실험 3 : 생화학(60분, 50점)

과제 : DNA와 염색된 샘플의 아가로즈 젤 전기영동


주의!

3명의 학생에게 하나의 전기공급원이 제공됩니다.

샘플을 젤에 올린 후, 전기 영동 탱크 아래의 검은 종이를 벗깁니다.


서론:

 전기 영동은 분자 생물학과 의학에 자주 사용되는 분석법이다. 분자의 총전하(net charge)는 적용된 전기장에서 분자의 이동정도에 영향을 미친다. 전기 영동 기술은 이러한 원리를 따르는 것이다.


아가로스 젤 전기 영동은 다음에 관한 정보를 얻는데 이용된다 ;


․ 여러 가지 목적으로 분리된 DNA와 RNA의 동정

․ DNA의 순수도 확인(검증)

․ DNA의 형태

․ DNA의 크기


 정제된 아가로스는 분말형태이며, 상온에서는 물에 녹지 않는다. 아가로즈를 녹이기 위해서는 물이나 완충액에 넣어 끓인다. 아가로즈가 식기 시작하면, 중합이 일어난다. 중합이 일어난 후 젤 위에 미리 만들어져 있는 레인(lane)에 샘플을 넣는다(로딩한다.)


 아가로스 젤에서 분자의 이동속도에 영향을 미치는 요인은 다음과 같다;

․ 분자 크기

․ 아가로즈 농도

․ 적용 전압

․ 분자 구조와 크기

․ 온도

․ 전기 영동 버퍼의 내용물(구성물)


실험


시약:


․ 염색약:

트리판 블루(Trypan blue)

산성 옐로우(Acid yellow)

비스마크 브라운(Bismarck brown)

메틸 그린(Methyl green)

푸크신(Fuchsin)

표지 염색약(Marker stain)

․ DNA 샘플

DNA 샘플 I

DNA 샘플 II(DNA와 결합하는 염색약이 DNA 샘플에 첨가되어 DNA를 볼 수 있게 한다.)

․ 40% 설탕 용액

․ 미리 준비된 1% 아가로즈 젤

․ 트리스-붕산-EDTA 버퍼(완충용액)



재료 및 기구

․ 2-20㎕ 마이크로피펫 + 피펫 팁

․ 1.5ml 에펜도로프 시험관과 집게

․ 장갑

․ 전기 영동 탱크와 젤 용기

․ 전원(전기 공급 장치)

․ 마커 펜



실험 전 주의


 학생들은 5개의 유기 염색약, 하나의 표지 염색약[오렌지Ⅱ, 자이렌 사이아놀, 브로모 페놀 블루의 혼합액], 2개의 DNA 샘플(인간 유전자 DNA: 3×109bp, 플라스미드 DNA; 5×103bp)을 받는다.


 이 실험에서는 미리 만들어진 lane(열)이 있는 아가로즈 젤이 제공된다. 다음에서 설명하는 대로 젤에 샘플을 올리고, 결과를 평가하시오.


실험하는 동안 장갑은 계속 착용하시오.


실험과정


단계1: 샘플 준비


 염색약이나 DNA 샘플이 들어 있는 각 시험관에 40% 설탕용액 5㎕를 넣는다. 각 시약마다 새 피펫 팁을 사용한다.


시험관 번호

1. 5㎕ 트리탄 블루 + 40% 설탕용액 5㎕

2. 5㎕ 산성 옐로우 + 40% 설탕용액 5㎕

3. 5㎕ 비스마크 브라운 +40% 설탕용액 5㎕

4. 5㎕ 메틸 그린 +40% 설탕용액 5㎕

5. 5㎕ 푸크신 +40% 설탕용액 5㎕

6. 5㎕ 표지 염색약(마커) +40% 설탕용액 5㎕

7. 5㎕ DNA 표본Ⅰ+ 40% 설탕용액 5㎕

8. 10㎕ DNA 표본 Ⅱ+40% 설탕용액 5㎕




단계2: 샘플을 lane에 넣는다.


 트리스-붕산-EDTA 버퍼는 전기 영동 쳄버에 미리 부어 놓는다. 1단계에서 준비한 샘플을, 앞에 제시한 순서대로(시험관 번호) 아가로즈젤 중간에 있는 각각의 lane에 넣는다. 각 샘플마다 깨끗한 마이크로 피펫 팁을 사용한다. 마이크로 피펫 팁을 lane 위로 가져가서 lane 벽 귀퉁이를 따라 샘플을 흘려 넣는다. 젤에 샘플을 넣을 때, lane 바닥에 구멍이 뚫리지 않도록 조심한다.



단계3 :


 전기 영동 쳄버 뚜껑을 닫고, 뚜껑의 전기선을 전원에 연결한다.

전원을 켠다.(붉은색 +, 검은색 -)


단계4 :


 90 볼트에서 20분간 전기 영동을 시킨다.


주의! 전원이 연결된 후에는 쳄버를 만지거나 버퍼에 손가락을 넣지 마시오.


주의: 실험이 이루어지기를 기다리는 동안 8쪽에서 시작되는 전기영동의 적용에 관한 Group A 문제를 푸세요.




단계5 :


 전원을 끄고, 전기선을 전원에서 떼어낸다. 젤 위의 샘플이동정도를 관찰하고 12쪽에 있는 그림에 표시한 후, Group B 문제를 푸세요.



질문


A 집단 질문 (전기 영동의 적용)


Ⅰ. 아래 사진은 실험실에서 순수 정제한 단백질(X)과 분자량 표준 샘플(M)을 SDS-PAGE(평면 수직 전기 영동)한 결과이다.

분자량 표준 단백질은 아래표와 같다.

단백질

분자량

이동거리(cm)

단백질 A

140.000

__________

단백질 B

100.000

__________

단백질 C

86.000

__________

단백질 D

45.000

__________

단백질 X

?

__________

1. 각 단백질이 젤에서 이동한 거리(샘플을 투입한 부위로부터 밴드 중앙까지의 거리)를 cm로 측정하고, 그 값을 위의 표에 써 넣으시오.


2. 분자량과 이동거리(cm)를 아래의 반지수 눈금 종이에 그려 넣으시오(10점).

3. 단백질 X의 분자량은?(5점)

__________


. 친자 확인 소송을 해결하려면, DNA 유전자 지문을 법적으로 이용한다. 아이, 엄마, 아빠의 게놈에서 무작위적으로 반복되어 나타나는 2개의 똑같은 DNA loci(좌)가 분석에 이용된다. 이러한 조각을 VNTR(Variable Number Tandem Repeats)라 하는데, 각 개인은 양친 중 한 쪽으로부터 VNTR을 담고 있는 특정 크기의 대립 유전자를 전달받고, 다른쪽으로부터는 상동이지만 그 VNTR과는 반드시 일치하지 않는 대립유전자를 전달 받는다. 이러한 실험에서 각 개인으로 부터의 2개의 VNTR DNA를 PCR로 증폭시켜 PCR 조각을 아가로즈 젤에 이동시켰다. 아래는 DNA 유전자 지문을 젤에서 이동시킨 결과이다. 누가 진짜 생물학적 아버지가 될 수 있는가?

_____ A) F1 _____ B) F2    _____ C) F3    _____ D) F4    _____ E) none



B 그룹 질문 (전기영동을 끝낸 후에 질문에 답하시오)

위 그림에 젤이 이동한 정도를 그리고, 다음 질문에 답하시오.


Ⅰ. 아래 빈 곳에 적당한 well 번호를 넣으시오.


1. 염색약이 중성인 곳(들)은 _______번이다(3점)

2. 염색약이 +전하를 띤 곳(들)은 _______번이다.(3점)

3. 염색약이 -전하를 띤 곳(들)은 _______번이다.(3점)

4. 샘플이 플라스미드 DNA인 곳은 _______번이다.(3점)

5. 샘플이 인간유전자 DNA인 곳은 _______번이다.(3점)

6. DNA를 염색하는데 이용될 수 있는 염색약은 _______번이다.(3점)

7. +극으로 이동한 두 개의 염색약 가운데 분자량이 큰 것은 _______번이고, 작은 것은 _______번이다.(3점)

8. -극으로 이동한 두 개의 염색약 가운데 분자량이 큰 것은 _______번이고, 작은 것은 _______번이다.(3점)

<해답>

실험 3 : 생화학

A 집단 질문

2. 


3. 64.000±2


II. B


B 그룹 질문


1. 3

2. 4, 5

3. 1, 2

4. 8

5. 7

6. 4, 5

7. 2, 1

8. 5, 4