실험 3 : 생화학(60분, 50점)
과제 : DNA와 염색된 샘플의 아가로즈 젤 전기영동
주의!
3명의 학생에게 하나의 전기공급원이 제공됩니다.
샘플을 젤에 올린 후, 전기 영동 탱크 아래의 검은 종이를 벗깁니다.
서론:
전기 영동은 분자 생물학과 의학에 자주 사용되는 분석법이다. 분자의 총전하(net charge)는 적용된 전기장에서 분자의 이동정도에 영향을 미친다. 전기 영동 기술은 이러한 원리를 따르는 것이다.
아가로스 젤 전기 영동은 다음에 관한 정보를 얻는데 이용된다 ;
․ 여러 가지 목적으로 분리된 DNA와 RNA의 동정
․ DNA의 순수도 확인(검증)
․ DNA의 형태
․ DNA의 크기
정제된 아가로스는 분말형태이며, 상온에서는 물에 녹지 않는다. 아가로즈를 녹이기 위해서는 물이나 완충액에 넣어 끓인다. 아가로즈가 식기 시작하면, 중합이 일어난다. 중합이 일어난 후 젤 위에 미리 만들어져 있는 레인(lane)에 샘플을 넣는다(로딩한다.)
아가로스 젤에서 분자의 이동속도에 영향을 미치는 요인은 다음과 같다;
․ 분자 크기
․ 아가로즈 농도
․ 적용 전압
․ 분자 구조와 크기
․ 온도
․ 전기 영동 버퍼의 내용물(구성물)
실험
시약:
․ 염색약:
트리판 블루(Trypan blue)
산성 옐로우(Acid yellow)
비스마크 브라운(Bismarck brown)
메틸 그린(Methyl green)
푸크신(Fuchsin)
표지 염색약(Marker stain)
․ DNA 샘플
DNA 샘플 I
DNA 샘플 II(DNA와 결합하는 염색약이 DNA 샘플에 첨가되어 DNA를 볼 수 있게 한다.)
․ 40% 설탕 용액
․ 미리 준비된 1% 아가로즈 젤
․ 트리스-붕산-EDTA 버퍼(완충용액)
재료 및 기구
․ 2-20㎕ 마이크로피펫 + 피펫 팁
․ 1.5ml 에펜도로프 시험관과 집게
․ 장갑
․ 전기 영동 탱크와 젤 용기
․ 전원(전기 공급 장치)
․ 마커 펜
실험 전 주의
학생들은 5개의 유기 염색약, 하나의 표지 염색약[오렌지Ⅱ, 자이렌 사이아놀, 브로모 페놀 블루의 혼합액], 2개의 DNA 샘플(인간 유전자 DNA: 3×109bp, 플라스미드 DNA; 5×103bp)을 받는다.
이 실험에서는 미리 만들어진 lane(열)이 있는 아가로즈 젤이 제공된다. 다음에서 설명하는 대로 젤에 샘플을 올리고, 결과를 평가하시오.
실험하는 동안 장갑은 계속 착용하시오.
실험과정
단계1: 샘플 준비
염색약이나 DNA 샘플이 들어 있는 각 시험관에 40% 설탕용액 5㎕를 넣는다. 각 시약마다 새 피펫 팁을 사용한다.
시험관 번호
1. 5㎕ 트리탄 블루 + 40% 설탕용액 5㎕
2. 5㎕ 산성 옐로우 + 40% 설탕용액 5㎕
3. 5㎕ 비스마크 브라운 +40% 설탕용액 5㎕
4. 5㎕ 메틸 그린 +40% 설탕용액 5㎕
5. 5㎕ 푸크신 +40% 설탕용액 5㎕
6. 5㎕ 표지 염색약(마커) +40% 설탕용액 5㎕
7. 5㎕ DNA 표본Ⅰ+ 40% 설탕용액 5㎕
8. 10㎕ DNA 표본 Ⅱ+40% 설탕용액 5㎕
단계2: 샘플을 lane에 넣는다.
트리스-붕산-EDTA 버퍼는 전기 영동 쳄버에 미리 부어 놓는다. 1단계에서 준비한 샘플을, 앞에 제시한 순서대로(시험관 번호) 아가로즈젤 중간에 있는 각각의 lane에 넣는다. 각 샘플마다 깨끗한 마이크로 피펫 팁을 사용한다. 마이크로 피펫 팁을 lane 위로 가져가서 lane 벽 귀퉁이를 따라 샘플을 흘려 넣는다. 젤에 샘플을 넣을 때, lane 바닥에 구멍이 뚫리지 않도록 조심한다.
단계3 :
전기 영동 쳄버 뚜껑을 닫고, 뚜껑의 전기선을 전원에 연결한다.
전원을 켠다.(붉은색 +, 검은색 -)
단계4 :
90 볼트에서 20분간 전기 영동을 시킨다.
주의! 전원이 연결된 후에는 쳄버를 만지거나 버퍼에 손가락을 넣지 마시오.
주의: 실험이 이루어지기를 기다리는 동안 8쪽에서 시작되는 전기영동의 적용에 관한 Group A 문제를 푸세요.
단계5 :
전원을 끄고, 전기선을 전원에서 떼어낸다. 젤 위의 샘플이동정도를 관찰하고 12쪽에 있는 그림에 표시한 후, Group B 문제를 푸세요.
질문
A 집단 질문 (전기 영동의 적용)
Ⅰ. 아래 사진은 실험실에서 순수 정제한 단백질(X)과 분자량 표준 샘플(M)을 SDS-PAGE(평면 수직 전기 영동)한 결과이다.
분자량 표준 단백질은 아래표와 같다.
|
단백질 |
분자량 |
이동거리(cm) |
|
단백질 A |
140.000 |
__________ |
|
단백질 B |
100.000 |
__________ |
|
단백질 C |
86.000 |
__________ |
|
단백질 D |
45.000 |
__________ |
|
단백질 X |
? |
__________ |
1. 각 단백질이 젤에서 이동한 거리(샘플을 투입한 부위로부터 밴드 중앙까지의 거리)를 cm로 측정하고, 그 값을 위의 표에 써 넣으시오.
2. 분자량과 이동거리(cm)를 아래의 반지수 눈금 종이에 그려 넣으시오(10점).
3. 단백질 X의 분자량은?(5점)
__________
Ⅱ. 친자 확인 소송을 해결하려면, DNA 유전자 지문을 법적으로 이용한다. 아이, 엄마, 아빠의 게놈에서 무작위적으로 반복되어 나타나는 2개의 똑같은 DNA loci(좌)가 분석에 이용된다. 이러한 조각을 VNTR(Variable Number Tandem Repeats)라 하는데, 각 개인은 양친 중 한 쪽으로부터 VNTR을 담고 있는 특정 크기의 대립 유전자를 전달받고, 다른쪽으로부터는 상동이지만 그 VNTR과는 반드시 일치하지 않는 대립유전자를 전달 받는다. 이러한 실험에서 각 개인으로 부터의 2개의 VNTR DNA를 PCR로 증폭시켜 PCR 조각을 아가로즈 젤에 이동시켰다. 아래는 DNA 유전자 지문을 젤에서 이동시킨 결과이다. 누가 진짜 생물학적 아버지가 될 수 있는가?
_____ A) F1 _____ B) F2 _____ C) F3 _____ D) F4 _____ E) none
B 그룹 질문 (전기영동을 끝낸 후에 질문에 답하시오)
위 그림에 젤이 이동한 정도를 그리고, 다음 질문에 답하시오.
Ⅰ. 아래 빈 곳에 적당한 well 번호를 넣으시오.
1. 염색약이 중성인 곳(들)은 _______번이다(3점)
2. 염색약이 +전하를 띤 곳(들)은 _______번이다.(3점)
3. 염색약이 -전하를 띤 곳(들)은 _______번이다.(3점)
4. 샘플이 플라스미드 DNA인 곳은 _______번이다.(3점)
5. 샘플이 인간유전자 DNA인 곳은 _______번이다.(3점)
6. DNA를 염색하는데 이용될 수 있는 염색약은 _______번이다.(3점)
7. +극으로 이동한 두 개의 염색약 가운데 분자량이 큰 것은 _______번이고, 작은 것은 _______번이다.(3점)
8. -극으로 이동한 두 개의 염색약 가운데 분자량이 큰 것은 _______번이고, 작은 것은 _______번이다.(3점)
<해답>
실험 3 : 생화학
A 집단 질문
2.
3. 64.000±2
II. B
B 그룹 질문
1. 3
2. 4, 5
3. 1, 2
4. 8
5. 7
6. 4, 5
7. 2, 1
8. 5, 4