D. 위의 답 모두Laboratory 3 : Plant pigment analysis
실험 3 : 광합성 색소의 역상 박층 크로마토그래피
<서론>
박층 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography)는 물질 분자의 분석에 있어 중요한 테크닉이다. 생물학자와 생화학자는 단백질 지질이나 식물 색소와 같은 물질 분자에 대하여 어떻게 많이 알게 되었을까? 오랜시간 동안의 물질 분자 분석이 답이 될 것이다. 물질 분자의 분석에 있어 중요한 기술이 바로 박층 크로마토그래피(TLC)이다. 이 기술은 친수성의 정지상과 소수성의 이동상에 대한 상대적인 친화력에 근거하여 서로 다른 종류의 물질 분자를 분리할 수 있다. 정지상(stationary phase)은 보통 유리판이나 금속판에 바른 살리실산(silicic acid, 실리카젤)의 얇은층이고 이동상(mobile phase)은 적당한 용매의 혼합물이다.
여러 새로운 기술이나 보다 효율적이고 정확한 기술로 대체되었지만 TCL은 시료 안에 있는 광합성 색소를 우선 정량적으로 분석할 수 있는 간단하면서도 효과적인 방법이다
광합성 색소의 분석에 있어 몇 가지 문제점이 드러났는데 예를 들면 색소가 살리실산에 있는 H2SiO3분자와의 반응에 의해 페오파이틴(Pheophytin)을 생성하는 것과 같은 문제이다. 이런 문제는 극성잔기를 C18-알킬사슬(alkylchains)으로 포화시킨 살리실산을 사용함으로써 피할 수 있다. 이는 비극성의 살리실산을 만들게 되는 것으로 적당한 용매(에틸아세트산과 메틸알코올과 물의 혼합물)를 이동상으로 사용하는 역상 TCL방법으로 알려졌다.
<준비물>
간단한 크로마토그래피용 탱크(200/250ml의 키가 큰 비커에 적지만 적당한 양의 용매를 넣고 페트리 접시로 씌워 놓는다.), 40×100mm크기로 자른 TCL절편 2개(적어도 60-80에서 30분간 건조시킴), 연필, 자, 알루미늄 호일, 시험관 3개(유리, 20㎖), 메스실린더(10㎖), 40-60도의 석유에테르(A병), 아세톤 100%(B병), 시험관에 넣은 증류수, 세사가 들어있는 시험관, 막자와 막자사발, 2개의 모세관(20μl), 콩식물, 실험방법이 소개된 과제 설명서, 선다형 문제지, 답안책자
과제 :
1. 역상TLC에 의한 식물 색소의 분리와 확인
2. TLC와 식물 색소에 관련된 선다형 문항을 해결함(답안책자 No.1사용)
3. 과제평가를 위해 2번 답안 책자를 완성함
시간이 끝나면 학생 각자는 2개의 답안 책자와 TLC판을 제출하여야한다.
과제1 : 역상TLC에 의한 색소의 분리
준비과정 (약15분)
1. 식물재료 8cm2를 준비한다.
2. 식물재료에 약간의 모래를 넣고 갈아준다.
3. B벙의 100% 아세톤(최대10ml)을 넣는다.
4. 시험관에 부어 넣고 5분후 따라낸다.(그동안 7번 과정의 TLC판을 준비한다.)
5. 약 20방울의 석유에테르(A병)를 약 5ml의 증류수에 넣는다.
6. 잘 섞고 두 층으로 분리되도록 한다.(분리되는데 1분을 기다린다.)
7. TLC판에 연필을 이용하여 아래쪽에서 1.5cm 떨어진 곳에 시작 선을 조심스럽게 그리고 희미하게 긋는다.(살리실산 면이 손상되지 않도록 한다.)
시료점 찍기 (약 5분)
1. 작은 모세관을 이용하여 시작선상의 서로 다른 세 점에 색소 추출액을 찍는다.(부드럽게 하여 살리실산 면이 손상되지 않도록 한다.)
2. 부드럽게 입김을 불어 추출액이 찍힌 점을 말리도록 한다.
3. 이런 과정을 4-5회 반복한다.
TLC 수행 (약25분)
1. TLC판을 탱크안에 넣고 어두운 곳에서 전개하도록 한다.(전체 장치를 알루미늄 호일로 덮는다.) 중요함 : 자유시간을 이용하여 선다형 질문에 답한다.(과제2)
2. 약20분후 판을 탱크에서 꺼낸다. 용매 상승선이 TLC판의 위쪽에서 1cm정도 떨어진 곳까지 도달한 경우에는 TLC판을 꺼내도록 한다.
분석
1. 연필을 사용하여 용매 상승선을 표시한다.
2. 답안 책자에 상승선과 시작선과 관찰한 색소를 포함하여 TLC판의 결과를 그려 놓는다.
3. 여러분이 분리한 광합성 색소의 Rf값을 계산한다.
중요한 점 : Rf값이 0.4와 같거나 큰 광합성 색소는 매우 약하게 보일 수 있다. 이와 같은 역상 TLC의 예로는 네오쟌틴(Rf=0.6) 비올라쟌틴(Rf=0.5) 루테인(Rf=0.4)들이 있다.
주의를 하더라도 페오파이틴이 나타날 수 있다. 만일 이런 색소가 나타나면 여러분은 이들을 흐릿한 청회색 부위로 보게 될 것이다. 이들은 광합성 색소로 간주하지 않는데 왜냐하면 이들은 화학적 변형과정을 거친 광합성 색소로부터 유래되었기 때문이다.
4. 여러분의 그림에 관찰한 각각의 광합성 색소를 표시한다. 가장 작은 Rf값을 갖는 색소점을 1번으로 하여 차례대로 번호를 매긴다. 이렇게 하여 Rf값이 가장 작은 4종류의 광합성 색소가 무엇인지 조사한다.
5. TLC판을 알루미늄 호일로 둘러싸서 색소의 색깔이 변하는 것을 방지한다.
6. 선다형 질문으로부터 얻은 정보를 포함하여 가능한 모든 정보를 이용하여 2번 답안 책자(19면)를 완성하고 “과제3”으로 가도록 한다.
과제 2 :
TLC와 식물 색소에 관련된 선다형 문항에 답하시오. 각 문항에서 가장 알맞은 답을 하나만 선택하시오.
각 문항에 대한 점수 배분
정답 = +3점
오답 = -1점(아무 답이나 쓰는 것을 막기 위해)
무답 = 0점
답안 책자 No1에 답을 적으시오.(page18)
1. 다음 설명 중 맞는 것은?
A. 식물은 엽록체를 가지고 있어 미토콘드리아가 없어도 살아갈 수 있다.
B. 엽록소와 GPA은 둘 다 가시광선을 흡수할 수 있도록 이중 결합의 광대한 체계를 갖고 있다.
C. 광합성에서 하는 엽록소의 역할은 미토콘드리아의 전자전달계에서 하는 헴의 역할과 동일하다.
D. 위의 설명 A, B, C가 모두 틀렸다.
2. 주요 식물 색소의 분자 구조를 (17쪽의 2점) 공부하여 극성 또는 비극성 용매에서 상대적 용해도를 추정하라. 이를 색소의 극성을 정하기 위해서 분자당 원자의 수를 셀 수 있다. 어떤 원자를 세는 것이 가장 맞는가?
A. 수소원자. B. 질소원자 C. 탄소원자 D.산소원자
3. 아세톤은 엽록체에서 색소를 분리하기에 매우 적당한 용매다. 이 사실을 지지하는 맞는 설명은 무엇인가?
A. 비극성 분자만이 비극성 용매에 녹는다.
B. 엽록체의 막은 극성 구조이다.
C. 비극성 분자만이 극성 용매에 녹는다.
D. 엽록체의 스트로마는 굉장히 많은 비극성 분자를 갖고 있다.
4. 때로 식물재료는 적색의 색소들을 갖고 있다. 이들 색소들의 구조는 이들이 광합성 작용에 아무런 기능을 갖지 못하여 수용성이라는 것을 알려준다. 식물세포에서 이들 색소가 있을 수 있는 가장 알맞은 장소는 어디인가?
A. 엽록체의 막 B. 미토콘드리아의 막 C. 액포의 안 D. 세포질
5. 엽록소는 헴에서 철과 결합한 포르피린 링과 구조적으로 비슷한 포르피린 링의 중심에 마그네슘 원자를 갖는 복잡한 분자 구조를 갖는다.
다음의 설명 중 맞으면서 그 분자의 기능에 대하여 정확하게 설명한 것을 고르시오.
A. 포르피린 링의 결합 네트워크안에 있는 전자는 빛을 흡수한다. 반면에 긴 소수성 꼬리는 틸라코이드 막에서 엽록소를 붙드는 것을 돕는다.
B. 긴 친수성 꼬리의 결합 사슬안에 있는 전자는 빛을 흡수한다. 반면에 포리피린의 네트워는 틸라코이드막에서 엽록소를 붙드는 것을 돕는다.
C. 포르피린 링의 결합 네트워크안에 있는 전자는 빛을 흡수한다. 반면에 긴 소수성 꼬리는 틸라코이드 막에서 엽록소를 붙드는 것을 돕는다.
D. 긴 소수성 꼬리의 결합사슬에 있는 전자는 빛을 흡수한다. 반면에 포르피린 링의 네트워크는 틸라코이드 막에서 엽록소를 붙드는 것을 돕는다.
6. 어떤 과학자가 독특한 광합성 색소를 갖고 있는 새로운 박테리아 종을 최근에 발견하였다. TLC상에서 이 색소는 붉은 노란색을 나타낸다. 이 색소가 흡수하지 않는 가시광선의 색깔은 무엇인가?
A. 붉은색과 노란색 B. 청색과 보라색 C. 녹색과 노란색 D. 청색, 녹색, 붉은색
7. 여러분이 어떤 식물 색소의 흡수 스펙트럼을 안다면 다음 중 가장 합리적으로 확신할 수 있는 것은?
A. 색소가 흡수하는 가시광선의 파장
B. 색소가 반사하는 가시광선의 파장
C. 색소가 흡수하고 반사하는 가시광선의 에너지
D. 위의 답 모두