Laboratory Ⅲ.
분자 생물학(Molecular Biology)
실습실험 시간 - 60분 : 40점
과제 : 플라스미드 pX DNA분절을 전기영동으로 분리하고, pX플라스미드의 제한효소 지도를 만드시오.
실험 조교가 실험 안전 수칙을 잘 지키고 정확하게 시료를 다루는지에 대해 5점을 부여할 것이다.
A - 실험 중 장갑을 사용하는지 : 1점
B - 전원장치를 사용하기 전에 조교에게 요청하는지 그리고 UV 투과기를 올바르게 사용하는지 : 1점
C - 피펫을 정확히 사용하는지 : 1점
D - 시료를 남김없이 웰(홈)에 로딩하는지 : 1점
E - gel을 부수지 않고 다루는지 : 1점
알림 : 3-4명당 1개의 전원장치 사용.
2명당 1개의 UV투과기를 사용.
실험 중 반드시 장갑을 착용하시오!
전원장치 작동은 조교가 할 것임!
기술적 설명
이론
전기영동은 분자의 전하, 분자량, 크기에 따라 분자들을 분리하는데 널리 사용하는 분석 방법이다. 비슷한 전하를 지닌 분자들을 분자량과 크기에 따라 분리하는 젤 매체에서 흔히 전기영동에 의한 분리를 한다. gel을 만들 때 사용되는 물질들을 완충용액(Buffer)에 녹여야 한다.
Plasmid DNA의 지도 작성
많은 세균에서 발견되는 plasmid는 환형의 이중나선 DNA분자로 구성되어 있다. 제한효소는 4-6염기를 특이적으로 절단하는 뉴클레이즈 효소이다. 예를 들어, HaeⅢ 제한효소는 두 가닥 DNA의 GGCC부위를 절단하지만 EcoRⅠ은 GAATTC부위를 특이적으로 절단한다. plasmid DNA 지도는 원형의 plasmid상에 상대적인 제한효소가 절단하는 부위를 표시한다. 이를 위해 우리는 제한효소들에 의해 생기는 DNA 조각의 길이를 알 수 있어야 한다. plasmid는 한 개 또는 여러 개의 제한효소로 동시에 자를 수 있다. 잘려진 DNA조각은 gel 상에 이동하여 밴드를 이루며 특별한 염색액을 사용하여 눈으로 볼 수 있다. DNA 분절이 전기영동 중 이동한 거리(샘플이 이동한 시작점에서 분절 밴드의 맨 앞쪽(홈에서 먼 쪽까지의 거리)는 DNA 분절의 길이(염기쌍의 수로 측정)의 로그값에 역비례한다. 가장 흔하게 사용되는 전기영동 gel은 아가로스이다. 아가로스 젤 내부의 pore 크기는 100KD이상의 분자량을 지닌 분자를 분리할 수 있을 정도로 크다.
실험장치
아가로스 gel 전기영동 탱크(용기)
그림 1의 4는 두 개의 전극이 있다. - 음극(5)과 양극(6)이다. 전기영동을 실시하기 전에 완충용액(Buffer)을 부어 gel 위까지 잠기게 한다(7). 분석하고자 하는 DNA 시료는 웰(1)에 넣는다. 시료 홈인 웰은 gel(2)을 gel받침대(3) 위에 놓고 특별한 콤(빗)으로 만든다. 전원장치를 연결하기 전에 전기영동 탱크의 덮개(8)를 덮는다.
그림1.전기영동 장치
액체를 다루는 데 사용되는 용량조절이 가능한 피펫(그림2)
그림2. 용량조절이 가능한 피펫
피펫 사용법
1. 조절링(3)을 돌려 적절한 용량까지 부피 눈금자(2)를 조절한다. 본 실험에서는 두 가지 부피를 다루게 된다.-5㎕와 10㎕. 그림3처럼 부피 눈금자를 조절한다.
그림3. 피펫의 부피 눈금자 상에 5㎕와 10㎕를 정확하게 맞추는 법.
2. 피펫 끝에 노란 tip(그림2의 1)을 끼운다.
Tip 없이 액체를 다루지 말것!
3. 버튼 (그림2의 4)을 처음 멈추는 곳까지 지그시 누르고 tip을 액체(시료)속에 넣는다. (그림4의 A)
4. 시료를 받아들이기 위해 버튼을 천천히 놓는다.(그림4의 B)
5. Tip을 액체에서 꺼내어 원하는 곳(다른 액체로 또는 gel의 홈으로)으로 옮긴 후 tip속에 있는 액체가 완전히 나올 때까지 버튼을 누른다.(그림4의 C)
그림4. 용액 취급 단계
6. 액체에서 피펫을 꺼낸 다음 버튼을 놓는다.(그림4의 D) 그리고 사용된 tip은 옆의 그림과 같이 라벨된 쓰레기통에 버린다.
각각의 용액이나 시료를 사용할 때 새 tip사용!
실제로 DNA시료를 다루기 전에 탱크(용기)안에 있는 완충용액을 이용하여 tip사용을 연습해 볼 수 있다.
실험재료
1. 0.5x TAE 완충용액에 0.8% 아가로스 gel이 만들어져 있음.
2. 전기영동 탱크에 0.5x TAE 완충용액을 채운다.
3. 2x GLB - 0.05% bromophenol blue 염색액, 10% 글리세롤이 포함된 gel loading 완충용액
4. St-로딩버퍼에 미리 혼합한, 크기를 알고 있는 DNA를 준비한 것임(자세한 설명은 아래)
5. B+C 란 제한효소 B와 제한효소 C로 자른 pX DNA plasmid를 지칭. 부피는 5 ㎕임
B+D 란 마찬가지로 제한효소와 B와 D로 자른 것임(자세한 설명은 다음에 나오는 “Q2"에서)
DNA 시료에 형광 DNA 염색약 Vistra Green (1:10,000 희석액)이 첨가되어 있음.
모든 제한효소가 사용된 시료는 pX DNA plasmid 임. pX plasmid의 길이는 4360염기쌍임.
실험(1단계)
Sample loading
1. 젤 #2와 #5 홈에 표준크기 DNA St를 10㎕씩 로딩한다.
2. 잘린 플라스미드 DNA 샘플인 B+C와 B+D를 각각(5㎕)에 2x GLB 용액 5㎕씩을 혼합한 10㎕씩을 gel에 로딩한다.(B+C는 #3 웰에 B+D는 #4 웰에 각각 로딩함)
3. 전기영동 장치 뚜껑을 닫는다.
손을 들어 조교를 부르시오!
전원장치를 작동하지 마시오. 이는 실험 조교의 우선권입니다.
(조교가 파워를 다룹니다.)
샘플을 20분간 러닝 하도록 한다. 시간을 염두해 두어 DNA 조각이 빠져나가지 않도록 할 것!
이 시간 동안에 아래 물음에 대한 답을 준비하도록 한다.
그림5. Sample loading
질문 (전기영동이 이루어지는 동안 답해야 할 문항 묶음입니다.)
Q1. pH 8.0인 전기영동 완충용액에서 DNA 분자는 음극에서 양극으로 이동한다.
응답지 Q1의 적합한 박스에 표시하시오.
-DNA 분자의 전하는?
A. 음성(-)
B. 중성
C. 양성(+)
D. 알 수 없음.
-DNA 분자의 전하를 주로 결정하는 성분은 무엇인가? (2점)
E. 퓨린 염기
F. 피리미딘 염기
G. 데옥시리보오스
H. 인산기
I. DNA 두 가닥 사이의 수소 결합
J. 위의 어느 것도 아님.
Q2. DNA 분절(조각)의 계산.
가정 (Given.)
1. 젤의 그림은 DNA 크기 표준과 플라스미드 pX를 제한효소 A, B, C, D로 잘라 만들어진 DNA 조각을 전기영동한 결과이다. (그림6)
2. 플라스미드 pX의 크기는 4360 염기쌍이고, 각 제한효소(A, B, C, D)는 한 번에 pX DNA 한 부분만을 자른다.
3. 효소A의 제한효소 작용부위는 이 플라스미드의 제한효소지도의 시작점으로 간주한다.
4. 효소A와 B를 함께 사용하여 자르면 DNA는 두 조각으로 잘리며 그 중 짧은 것의 길이는 380 염기쌍이다. (그림7 참조)
5. 그림6의 1번 레인에서 DNA 크기 표준 밴드의 DNA 분절의 길이는 다음과 같다. (그림6의 1번레인) : 3,000; 2,000; 1,500; 1,200; 1,031; 900; 800; 700; 600; 500; 400; 300; 200; 100 (염기쌍)
500염기쌍 분절의 밴드는 이웃한 밴드에 비하여 굵게(진하게) 보였다.
500염기쌍보다 더 짧은 DNA 조각의 밴드는 젤에서 약하게 보이거나 보이지 않을 수 있다.
추정(Estimate)
Q2A. 그림6의 레인1의 크기 표준 DNA 분절에 로만숫자( I ~ Ⅵ )로 표시된 DNA 분절의 크기(염기쌍으로 표시)는 얼마인가? 답지 리스트 Q2A표의 I ~ Ⅵ의 박스 안에 답을 쓰시오. (3점)
레인은 젤 아래에 번호를 붙였으며 웰(홈)은 위 부분에서 볼 수 있다.
Lane 1 - 길이 표준 DNA 분절
Lane 2 - 플라스미드 pX를 효소 A+C로 자름
Lane 3 - 플라스미드 pX를 효소 A+D로 자름
Lane 4 - 플라스미드 pX를 효소 C+D로 자름
Lane 5 - 길이 표준 DNA 분절
그림6. 플라스미드 pX의 분절조각의 전기영동 분리 결과
Q2B. 답지리스트 Q2B 좌표에, 그림6의 로만 숫자로 표기한 표준길이 DNA 분절의 밴드가 이동한 거리(cm)와 여러분이 Q2A에서 조사한 DNA 분절의 길이를 플롯하시오. 플롯한 점으로 그래프를 그리시오.
X축에는 웰에서 밴드의 앞쪽 끝(먼쪽)까지의 거리를, Y축에는 DNA 분절의 길이를 표시한다.
Q2C. Q2B에서 만든 그래프를 이용하여 그림6의 레인 2, 3, 4에 제시된 DNA 분절의 크기를 조사하시오. 답지리스트 Q2C표의 젤의 2, 3, 4번 레인에 각각 해당하는 2, 3, 4 칼럼에 답을 쓰시오.(허용 정확도는 정확한 수치의 ∓10% 수준) (6점)
Q2D. (그림6의 2번 레인) 젤 로딩 버퍼를 혼합한 후 A+C 샘플의 DNA 농도는 150ng/ℳℓ이며 10ℳℓ를 젤에 로딩하였다.
젤에 로딩한 DNA(나노그램)의 양은 얼마인가? 답지리스트 Q2D표의 1번 칼럼에 쓰시오.
그림6의 2번 레인(A+C)의 두 밴드는 각기 얼마씩의 DNA(나노그램)를 함유하고 있는가? (로딩한 모든 DNA가 두 밴드에 나누어 졌다고 가정한다.) 답지리스트 Q2D표의 2번 칼럼(가장 큰 DNA 분절의 밴드)과 3번 칼럼(가장 작은 DNA 분절의 밴드)에 답을 적으시오.(허용정확도 ∓10%) (6점)
젤이 준비될 때까지 시간이 있다면, (그림7) 플라스미드 지도의 C와 D 제한효소에 의해 잘려진 위치를 찾아볼 수 있다. Q2C의 답의 결과를 이용하시오.
실험(두 번째 단계)
전기영동을 시작하고 20분이 지나면 조교가 전기영동 탱크에 연결된 전원장치의 전원을 끊을 것이다. 실험 조교에서 시간을 확인하는데 주저하지 마시오.
그 후에는:
1. 쟁반에 젤 지지대와 젤을 함께 넣어 UV(자외선) 투과기에 가져간다. (투과기의 번호는 여러분의 작업 장소에 적혀있다.)
2. 투과기의 보호 쉴드를 들어 올린다.
3. 자외선 투과기 위에 젤을 올려 놓는다.
4. 보호 쉴드를 닫고 UV광원을 켠다.
보호 쉴드가 열려있는 동안에 자외선 투과기의 광원을 켜지 말 것!
자외선 광원이 켜져 있을 때 보호 쉴드를 들어 올리지 말 것!
5. DNA 밴드의 이미지를 관찰하고 답지 리스트 Q3에 주어진 틀에 밴드 패턴을 그리시오.
여러분이 그린 그림의 DNA 밴드는 여러분의 젤에 있는 표준 크기 DNA에 대해 상대적으로 정확하게 맞추어야 합니다. (4점)
6. 자외선 광원을 끄고 젤 지지대와 젤을 함께 자외선 투과기에 남겨 놓는다.
7. 종이 타올로 손을 닦고 계속 답을 할 준비를 한다.
질문(두 번째 세트의 질문은 젤에서 절편 분리를 기록한 후에 답하도록 한다.)
Q4A. 표준 크기 DNA의 밴드와 샘플의 밴드 위치를 비교하여 잘려진 DNA의 대략의 분절 길이를 결정하시오. 답지 리스트 Q4표에 3번과 4번 레인에 해당하는 답을 3번과 4번 칼럼에 적으시오.(허용 정확도는 ∓20%) (4점)
Q4B. 그림6에서 표시된 젤의 분석과 여러분 자신의 젤에서 얻은 데이터를 고려하여 플라스미드(답지 Q4B)에 효소C와 D의 제한효소 절단부위를 박스에 C, D로 표기하시오. (6점)