14 th INTERNATIONAL BIOLOGY OLYMPIAD 8-16 JULY 2003 Minsk, Belarus

PRACTICAL TEST(실험평가)

3

Microbiology and Biotechnology

(미생물과 생물공학)

학생 번호:

참가자들에게

14회 국제 생물 올림피아드의 실험 영역은 4가지 실험으로 구성된다.

1. 식물 생리, 형태, 해부

2. 동물 형태, 해부, 분류

3. 미생물과 생물공학

4. 유전학

실험 시간은 1시간으로 구성된다.

각각의 실험이 끝난 후 10~15분의 휴식 시간이 주어진다.

실험이 바뀔 때에는 조교의 도움을 받을 것이다.

여러분의 행운을 빈다!

실험 영역

실험실에서

1. 봉투를 여시오. 문제지와 답지가 주어질 것이다.

   겉표지에 이름, 성 그리고 코드번호를 쓰시오. 답안지의 모든 페이지에는 코드번호를 쓰시오.

2. 주어진 재료와 도구에 관한 질문만이 허용된다.

3. 한 시간이 경과되면 조교가 문제지와 답지를 회수할 것이다. 답안지만을 이용하여 채점을 할 것이다.

여러분의 행운을 빈다!

참가자들에게

“미생물학과 생물공학” 실험에서는 다음 두 과제가 요구 된다:

과제1. 미생물의 동정

과제2. 서로 다른 유전자를 발현하는 배양 세균의 연구

      실험 시간: 60분임.

      최대 점수:64점.

실험결과와 답은 답안지에 적어라. 이 답안지는 시험 시간이 종료도면 조교가 회수해 갈 것이다. 문제지에는 답안 내용을 써도 좋지만 반드시 기록할 필요는 없다.

답안지는 실험실로부터 밖으로 가져나갈 수 없다.

화학반응을 시킬 때 시약이나 용액이 피부나 옷에 닿지 않도록 조심하시오.

실험 시험이 끝난 후에 소독액으로 손을 씻으시오.

행운을 빕니다!

국가명                       

이름                                        성                             

코드                         

과제1.(46점) 미생물의 동정.

재료 및 기구

1. 세균 균주:

- 고형 배지가 있는 페트리 접시들(GCO접시1개, protease라고 라벨되어 있는 접시-1개, amylase라고 라벨되어 있는 접시-1개)

- 고형 배지가 들어 있는 시험관들(O/F 검사를 위한 것)

- 고기즙이 들어 있는 시험관들(H₂S검사와 NR검사를 위한 것)

2. 고형배지로부터 슬라이드 글라스 위로 미생물을 옮기기 위한 나무 이쑤시개

3. 슬라이드 글라스

4. 피펫

5. 3% KOH 용액

6. 3% 과산화수소수 용액

7. 1% DMPA 용액

8. Lugol 용액

9. 1% Griess 용액

미생물을 동정할 때 주로 형태학적, 생리학적, 생화학적 특성과 같은 생물학적 특성에 기초한다. 학생은 No1~5까지의 5가지 미생물 균주가 어떤 종인지 동정해야 한다. 이를 위해서 1.1, 1.3, 1.4, 1.6, 1.8의 5가지 생화학적 검사실험을 실시해야 하고, 1.2, 1.5, 1.7의 실험결과도 이용해야 한다. 어떤 검사(실험)들에 대해서는 해당 주제에 대해 묻는 추가 질문들이 있다.

답안지의 “세균 동정”표에 다음과 같은 기호를 사용하여 학생의 실험 결과를 나타내어라. “+” 양성반응. “-” 무반응. 답안지 표의 예가 다음 페이지에 있다.

주의! 그램 반응란에 그램 양성세균에 대해서는 “+”를, 그램 음성 반응에 대해서는 “-”를 표시한다. O/F 검사란에 발효대사(혐기성, 무산소 호흡)를 하는 미생물에 대해서는 F를, 호기성(산소)대사를 하는 미생물에 대해서는 O를 표시한다.

검사 중에는 마지막 칸을 제외한 나머지 칸을 모두 채운다. 그리고 나서 이 과제1의 9면에 소개된 동정표를 이용하여 해당 미생물을 동정하고, 그 미생물 종에 해당하는 기호를 “동정 결과”란(마지막 칸)에 기록한다.

세균의 동정 (30점)

균주	그램반응	O/F 검사	존재 여부						동정 결과
			카탈라아제	산화효소	단백질분해효소	아밀라아제	H2S생성	질산이온 환원효소
1
2
3
4
5

실험을 할 때 시약이나 용액이 피부나 옷에 닿지 않도록 조심하시오!

사용한 피펫, 나무 이쑤시개, 슬라이드 글라스, 여과지 등은 실험대 위에 있는 통에 넣으시오!

시험 1.1. 그램 반응

그램반응 검사에 필요한 것들L

1. 세균 균주 No 1~5(GCO 접시로부터)

2. 3% KOH 용액

3. 슬라이드 글래스 5장

4. 나무 이쑤시개

주의: GCO 접시는 나중에 검사 1.3과 1.4에서도 필요하다.

실험(검사)을 1.1, 1.3, 1.4 순서로 행하시오.

실험 방법:

분액병을 사용하여 슬라이드 글라스 위에 3% KOH 용액을 소량 떨어뜨린다. 이쑤시개를 사용하여, KOH 용액에 적당량의 한 균주(지름 약 3~4mm)를 옮기되, 한천은 옮기지 않도록 한다. KOH 용액과 세균을 잘 섞는다. 만약 세균의 일부가 이쑤시개에 붙으면 움직여서 떨어뜨려라. 균주는 그램-음성이나 그램-양성이다. 만일 반응결과가 분명하지 않으면 검사 실험을 다시 반복할 수 있다.

매 실험마다 반드시 새 이쑤시개를 사용하여 나머지 균주에 대해서도 실험을 한다. 실험 결과를 답안지의 “세균 동정” 표의 해당란에 표시하고, 그램 양성 세균은 “+”, 그램 음성 세균은 “-”로 표시한다.

시험 1.2. O/F 검사

O/F 검사를 이용하면 세균이 호기성(유산소) 조건과 혐기성(무산소) 조건에서 포도당을 이용하는 능력을 검사할 수 있다.

주어진 균주가 산소가 있는 조건과 없는 조건에서 포도당을 사용하는 능력이 있는지를 결정하기 위해 각 균주를 필수 무기 염류, 포도당 그리고 pH 지시제(산성에서 청색, 중석에서 분홍색, 염기성에서 적색)를 포함한 2개의 시험관에 미리 접종하였다. 혐기성(무산소) 조건을 만들기 위해서 시험관 1a~5a는 균주 접종 후 즉시 바젤린 오일을 떨어뜨려 공기와의 접촉을 차단하였고, 시험관 1b~5b는 oil을 떨어뜨리지 않고 그대로 두었다. 모든 시험관들은 항온기에서 24시간동안 배양되었다.

각 균주에 대해서 시험관 안의 색 변화를 분석하시오. 이 결과를 답안지의 세균동정 표에서 “O/F 검사”란에 표시하시오. 발효대사(무산소 대사)를 갖는 미생물은 F, 호기성 대사(유산소 대사)를 갖는 미생물은 O로 표시하시오.

시험 1.3. 카탈라아제 검사

검사 실험에 필요한 것들:

1. 균주 No1~5

2. 3% H₂O₂ 용액

3. 슬라이드 글라스 5장

4. 나무 이쑤시개

5. 피펫

실험 방법:

피펫을 이용하여 슬라이드 글라스 위에 과산화수소수용액을 한 방울 떨어뜨린다. 이쑤시개를 이용하여 GCO 접시에 있는 한 세균주 적정량을 슬라이드 글라스 위의 과산화수소 용액에 옮기되, 한천은 옮겨지지 않도록 한다. 세균을 과산화수소수용액과 잘 섞는다. 세균을 용액과 섞으면서 결과를 기록하시오. 나머지 4개 균주에 대해서도 같은 과정을 반복하시오. 검사결과를 답안지의 세균 동정표에서 해당란에 “+” 또는 “-”로 표시하시오.

문제 1.3.1.(2점) 다음 중 카탈라아제에 의해서 이루어지는 촉매반응은 어느 것인가?

      A. 3H₂O₂ + FADH₂ → 3H₂O + O₂ + H₂ + FAD

      B. 2H₂O₂ → H₂O + O₂

      C. H₂O₂ → 2HO

      D. H₂O₂ → 2HO₂ + H₂

      E. 2H₂O₂ + NADH + H⁺ → 2H₂O + NAD⁺

정답에 해당하는 코드(들)를 1.3.1. 에 쓰시오.

1.3.1.                                   

시험 1.4. 시토크롬 산화 효소 검사

실험에 필요한 것들:

1. 균주 No1~5 까지의 콜로니가 있는 GCO 접시

2. 1% DMPA 용액

실험 방법:

분액병을 이용하여 DMPA 한 방울씩을 각 콜로니에 떨어뜨린다. 30~60초 후에 산화제에 양성반응을 보이는 균주의 콜로니는 핑크색에서 암적색으로 변한다. 각 균주에 대해 콜로니 색깔의 변화를 분석하고 그 결과를 답안지의 세균 동정표의 해당란에 표시하시오(색 변화가 있으면 “+”, 없으면 “-”).

문제 1.4.1. (4점) 시토크롬 산화효소에 양성 반응을 보이는 세균에 대한 진술로서 옮은 것을 모두 고르시오.

A. 호흡 연쇄에서 최종 전자 수용체로 O₂를 사용할 수 있다.

B. 모두 혐기성(무산소) 호흡을 할 수 없다.

C. 모두 호기성(유산소) 호흡을 한다.

D. 모두 혐기성(무산소) 호흡을 한다.

E. 모두 경우에 따라서 호기성 호흡을 하거나 혐기성 호흡을 한다.

F. 어떤 균주에서는 시토크롬 산화효소가 화학(호학에너지 이용)합성에 관여한다.

답에 해당하는 기호들을 1.4.1.에 쓰시오.

1.4.1.                               

1.5. 단백질 분해효소 활성 검사

단백질 분해효소의 활성을 검사하기 위해서는 카제인을 포함하는 배지에 균주 No1~5를 미리 접종한 페트리접시를 분석해야 하는데, 이 접시는 “protease"라고 라벨이 되어 있다. 답안지의 표에 결과를 표시하시오.

시험 1.6. 아밀라아제 검사

“amylase:라고 라벨이 되어 있는 접시에는 0.2% 녹말이 첨가된 고형 배지가 들어 있고 균주 No1~5가 미리 접종되어 있다. 이 접시 표면을 루골(Lugol) 용액으로 처리하고 어느 세균이 아밀라아제 활성을 갖는지 조사하시오. 반응 결과를 답안지의 세균 동정표의 해당란에 표시하시오. 

1.7. H₂S 생성 검사

이 실험에서는 미리 준비된 5개의 시험관을 검사한다. 각 시험관에는 고기즙이 들어 있고 검사하고자 하는 균주가 미리 접종되어 있다. 시험관들에는 아세트산 납 용액으로 포화시킨 흰 색의 지시 종이도 들어 있다. 지시 종이 색깔의 변화를 조사하고 답안지의 표에 결과를 표시하시오. 다음 두 질문에 대한 답의 기호를 답안지에 쓰시오.

문제 1.7.1. (4점) H₂S를 생성하는 세균이 고기즙 배지에서 생장할 때 H2S는 다음중 어떤 물질로부터 생성되는 것인지 모두 고르시오.

A. RNA	F. Glycine
B. DNA	G. Thiamine
C. Arginine	H. Biotin
D. Methionine	I. Taurine
E. Serine	J. Cysteine

답에 해당하는 기호들을 1.7.1.에 쓰시오.

1.7.1. :                             

문제 1.7.2.(2점) 지시 종이의 색을 변화시키는 화학 반응 과정에 대한 반응식으로 옳은 것은?

A. 2CH₃COOH + H₂S → (CH₃CO)₂S + 2H₂O

B. Pb²⁺ + S^2- → 2CH₃COOH + Pb + S

C. (CH₃COO)₂Pb + H₂S → CHSCOOH + 2H₂

D. 2CH₃COOH + H₂S → CHSCOOH + 2H₂

E. 2CH₃COOH + Pb + 2H₂S → 2C₂H₆ + PbSO₄ + S

답에 해당하는 기호들을 1.7.2.에 쓰시오.

1.7.2. :                             

1.8. 질산염 환원효소 검사(NR-검사)

실험에 필요한 것들:

1. NR이라고 라벨되고 균주 No1~5 용액이 들어있는 시험관들

2. 1% Griess 시약

3. 피펫

세균 용액에 1% Griess 시약을 1㎖ 첨가한다. 질산염 환원효소 활성이 있으면 1분 이내에 적색이 나타난다. 답안지의 표에 결과를 표시하시오.

문제 1.8.1.(4점) 질산염 환원효소가 존재하면:

A. 화학합성 과정의 전자전달계에서 질산염을 전자수용자로 이용한다.

B. 호흡과정의 전자전달에서 질산염을 전자공여자로 이용한다.

C. 화학합성 과정의 전자전달계에서 질산염을 전자공여자로 이용한다.

D. 호흡과정의 전자전달계에서 질산염을 전자수용자로 이용한다.

E. 질산염은 질소원으로 이용한다.

답에 해당하는 기호들을 1.8.1.에 쓰시오.

1.8.1.                               

검사결과와 아래의 세균 동정표를 이용하여 각 균주가 어느 종인지 결정하시오. 그 결과를 답안지의 표에 적으시오.

동  정  표

	속, 종 명	그램 반응	O/F 검사	존재 여부
				카탈라아제	산화효소	단백질 분해효소	아밀라아제	H2S 생성	질산이온 환원효소
A	Escherichia coli	-	F	+	-	+	-	+	+
B	Xanthomonas campestris	-	O	+	-	+	-	+	-
C	Lacobacillus delbrueckii	+	F	-	-	+	-	+	-
D	Erwinina herbicola	-	F	+	-	-	-	+	+
E	Clavibacter michiganensis	+	O	+	-	-	+	+	-
F	Staphylococcus saprophyticus	+	F	+	-	-	-	-	-
G	Pseudomonas mendocina	-	O	-	+	-	-	-	+
H	Pseudomonas putida	-	O	+	+	+	-	-	-
I	Sarcina Iutea	+	F	+	-	+	-	-	-
J	Streptobacillus moniliformes	-	F	-	-	-	-	-	-
K	Agrobacterium tumefaciens	-	O	+	+	-	-	+	+
L	Pseudomonas fluorescens	-	O	+	+	+	-	-	+
M	Bacillus subtilis	+	F	+	-	+	+	+	-
N	Streptococcus lactis	+	F	-	-	+	-	+	+

과제 2. 서로 다른 유전자를 발현하는 배양 세균의 연구(18점)

재료 및 기기

1. 서로 다른 성장 시기에 있는 배양 세포

2. 증류수(플라스크 A)

3. 0.5M 카테콜 용액이 담겨있는 시약병(플라스크 B)

4. 피펫

효소 카테콜-2,3-디옥시지나아제를 암호화하는 유전자 xy/E는 다양한 유전자의 발현을 연구하는 데 사용되는 리포터 유전자이다. 이 효소는 무색의 카테콜을 노란색 산물인 하이드록시뮤코닉 세미알데히드로 전환하는 반응을 촉매 한다. 프로모터가 없는 xy/E 유전자를 관심 있는 유전자의 프로모터에 재조합 시키면 반응산물의 노란색 색깔의 발현과 정도에 따라 분석할 유전자의 발현을 확인할 수 있다.

xy/E 유전자를 유전자 C와 유전자 D의 서로 다른 유전자의 프로모터에 실험적으로 재조합시킨 대장균의 두 균주를 만들었다. 그림1은 Ⅰ과 Ⅱ로 표지한 이 세균의 생장곡선이다(Ⅰ은 xy/E 유전자를 유전자 C의 프로모터에 재조합시킴, Ⅱ는 xy/E 유전자를 유전자 D의 프로모터에 재조합시킴). 화살표는 배양세포 샘플을 수집한 시점을 나타낸다. 그림1의 화살표에 적힌 숫자는 시험관 번호를 의미한다.

유전자 C와 D가 발현되는 세포배양의 시기를 조사하시오.

이를 하기 위하여 여러분은 다음의 활동을 수행해야 한다:

1) 피펫의 표시된 부분까지 물(플라스크A)로 채워서 각 시험관에 옮긴다,

2) 시약병(플라스크 B)의 카테콜 용액 한 방울씩을 각 시험관에 떨어뜨리고 시험관의 내용물을 흔들어서 잘 섞어준다,

3) 시험관을 실온에 3~5분간 놓아둔다,

4) 각 시험관에서 노란색 발현을 조사한다.

유전자 C와 D가 어느 생장 단계에서 발현되는지 조사하여 답지의 표에서 해당 칸에 “+”로 표시하시오.

균주	유전자	유전자가 발현되는 시기
		초기 대수생장기	후기 대수생장기	정지기
Ⅰ	C
Ⅱ	D

답안지                                                                               

과제 1.(46점)

세균의 동정(30점)

균주	그램반응	O/F 검사	존재 여부						동정 결과
			카탈라아제	산화효소	단백질분해효소	아밀라아제	H2S생성	질산이온 환원효소
1	+	F	+	-	+	+	+	-	M
2	-	F	+	-	+	-	+	+	A
3	-	O	+	+	+	-	-	-	H
4	-	O	+	+	-	-	+	+	K
5	-	O	+	+	+	-	-	+	L

1.3.1.(2점): B

1.4.1.(4점): A, F (한개는 맞고, 한개는 틀렸으면 2점)

1.7.1.(4점): D, J

1.7.2.(2점): B

1.8.1.(4점): A, D

과제 2.(18점)

균주	유전자	유전자가 발현되는 시기
		초기 대수생장기	후기 대수생장기	정지기
Ⅰ	C	+(3점)	-(3점)	-(3점)
Ⅱ	D	-(3점)	-(3점)	+(3점)