16th International Biology Olympiad
Beijing
July 2005
Practical Examination
Part I
Total time available: 90 minutes
The 16th IBO Practical Tests
First name(이름):
Last name(성):
Country(국가명):
Code(학생수험번호):
주의:
1. 성명과 수험번호를 문제지와 답안지에 모두 기재하시오.
2. 특별히 다르게 지시되지 않은 이상, 모든 결과는 반드시 답안지에 기재하시오.
3. 실험 시험은 4개의 평가(parts)로 되어 있고, 각 평가(part)의 시험 시간은 90분씩이다. 4개의 평가 중 어느 평가를 첫 번째 실험으로 시작해야 하는가는 학생의 수험번호에서 마지막 숫자에 따라 다르다. 예를 들어, 학생의 번호가 221이라면, 그 학생은 평가Ⅰ(PartⅠ)을 첫 번 째 평가로 한다. 그리고 번호가 223인 학생은 평가Ⅲ(PartⅢ)을 첫 번째 평가로 한다.
4. 두 번째 실험평가는 다음과 같다. PartⅠ(평가Ⅰ)을 한 학생은 PartⅡ(평가Ⅱ)를 실시한 학생과 서로 실험실을 바꾼다. 그리고 PartⅢ(평가Ⅲ)를 실시한 학생은 PartⅣ(평가Ⅳ)를 실시한 학생과 서로 실험실을 바꾼다.
5. 세 번째 실험 평가는 다음 규칙에 따라 선택하여 실시한다.
수험번호의 끝자리 숫자가 1이면, PartⅢ(평가Ⅲ)를 세 번째 실험으로 한다.
수험번호의 끝자리 숫자가 2이면, PartⅣ(평가Ⅳ)를 세 번째 실험으로 한다.
수험번호의 끝자리 숫자가 3이면, PartⅠ(평가Ⅰ)를 세 번째 실험으로 한다.
수험번호의 끝자리 숫자가 4이면, PartⅡ(평가Ⅱ)를 세 번째 실험으로 한다.
실험실을 바꿀 때는 가이드(안내자)의 지시를 따라야 한다.
Practical tests PartⅠ
Biochemistry and Molecular biology(생화학 및 분자생물학)
주의: 반드시 과제1을 먼저 시작하고, 과제1에서 전기영동을 하는 동안 과제2를 진행하시오.
과제1. 아가로스젤 전기영동법을 이용한 플라스미드 DNA 제한효소 절편의 분리 (24점)
<실험기구> 원심분리기, 아가로스젤 전기영동 장치, 형광젤 판독 장치
<주의> “전기영동 장치에 전원을 연결할 때에는 실험대 위의 파란색 카드를 들어 도움을 청하세요”
Introduction
플라스미드는 원형의 이중나선 DNA 분자로, 세균 세포 안에서 염색체와 별개로 존재하며 독립적으로 복제된다. 제한효소는 플라스미드 DNA를 절단할 수 있다. 본 실험에서는 플라스미드와 제한효소 BamHI, PstI, HindⅢ 가 사용된다. 제한효소를 이용하여 플라스미드 DNA를 절단한 다음, 아가로스젤 전기영동을 할 것이다. 제한효소의 절단자리를 밝히고 DNA 절편의 이동 거리를 측정하여 제한효소 절편의 길이를 계산하시오. DNA 절편의 이동 거리는 조각 길이의 로그값에 반비례한다.
재료
1. 1×TAE 완충용액(Tris-acetate-EDTA)
2. DNA 염색약- GeneFinderTM (안토시아닌과 설탕 포함)
3. 제한효소 BamHI
4. 제한효소 PstI
5. 제한효소 HindⅢ
6. 플라스미드 DNA
7. 길이를 아는 DNA size standard
8. 증류수
기구
1. 장갑
2. 유성펜
3. 0.5ml 원심분리용 튜브
4. 원심분리용 튜브 받침대
5. 피펫
6. 원심분리기
7. 인큐베이터
8. 아가로스젤 전기영동 장치
9. 형광젤 판독 장치(실험 조교가 담당)
실험기구 사용방법
1. 마이크로피펫
0~10μl 마이크로피펫이 사용된다. 조절나사를 돌려 시료의 양을 조절한다. 시료의 양을 나타내는 숫자는 위에서부터 읽는다. 적당한 피펫팁을 꽂은 다음 조절 버튼을 살짝 눌러 첫 번째로 저항이 느껴지는 상태에서 피펫 끝을 시료에 담근다. 조절 버튼에서 손가락을 천천히 떼어 시료를 흡입한다. 시료가 담긴 피펫 끝을 새로운 튜브에 옮긴 다음 시료가 완전히 빠져나갈 때까지 꾹 누른다. 팁 제거 버튼을 눌러 사용한 팁을 매번 갈아준다.
2. 원심분리
앞쪽의 손잡이를 눌러 뚜껑을 연다. 로터에 튜브를 장착한다. 반드시 로터에서 마주보는 곳에 튜브를 넣어 균형을 이루도록 한다. 뚜껑을 눌러 닫아 뚜껑이 제자리를 잡게 한다. 뚜껑이 제대로 닫히면 로터가 회전하기 시작할 것이다. 20초 동안 원심분리한다. 앞쪽의 정지 손잡이를 누르고, 원심분리기가 완전히 멈추면 튜브를 꺼낸다.
3. 제한효소 절단
제2형(TypeⅡ) 제한효소는 특정한 DNA 서열을 인식하여 인식한 자리 부분에서 DNA를 절단한다. 제공된 플라스미드 DNA를 세 종류의 제한효소(BamHI, PstI, HindⅢ)를 이용하여 자른다. 원심분리용 튜브에 들어있는 플라스미드 DNA에 제한효소를 넣고 뚜껑을 닫는다. 튜브 바닥을 손끝으로 조심스럽게 튕겨주면서 시료를 섞는다. 37℃에서 15분간 반응시킨다.
4. 아가로스젤 전기영동 장치
0.8% 아가로스젤이 준비되어 있다. 1×TAE 완충용액을 전기영동 장치에 젤 표면이 잠길 정도로 붓는다. 완충액의 수면에서 젤 표면까지의 거리는 3~4mm 정도가 되게 한다. 시료 10μl를 젤에 로딩한다. 시료에는 (1) 제한효소로 잘린 플라스미드 DNA와 (2) DNA 염색약이 포함되어 있다.
<주의> “마이크로피펫 팁 끝부분이 웰 바닥에서 1~2㎜ 떨어진 위쪽에서 로딩해야 웰의 바닥에 구멍이 뚫려 시료가 새는 것을 막을 수 있다.” 로딩이 끝나면 전기영동 장치의 뚜껑을 덮는다. 빨간 전선은 (+)극 검정색 전선은 (-)극에 연결한다. 파란 카드를 들어 실험조교가 전원을 켜도록 신호를 보낸다. 100볼트에서 40분간 전기 영동한다. 40분이 지나면 다시 파란 카드를 들어 조교가 전원을 끄도록 한다. 젤 박스는 각자 하나씩 사용하지만 전원 공급 장치는 두 사람이 하나를 공유한다.
5. 젤 판독장치
이 장치의 사용은 실험 조교가 담당한다. 시료에는 DNA 절편과 결합하여 눈으로 확인할 수 있게 하는 비독성 염색약이 들어 있다.
실험방법
1. 8개의 0.5ml 원심분리 튜브에 유성펜으로 1~8번의 숫자를 기재한다. 다음 페이지에 나타난대로 시료를 첨가한다. 마이크로피펫팁은 매번 새 것을 사용한다.
<주의> “튜브에 기재된 숫자와 젤에 로딩하는 순서가 다르니 주의하시오.”
|
연번 |
플라스미드DNA(㎕) |
BamHI (μl) |
PstI (μl) |
HindIII (μl) |
ddH2O (μl) |
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1 |
5 |
1 |
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9 |
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2 |
5 |
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1 |
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9 |
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3 |
5 |
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1 |
9 |
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4 |
5 |
1 |
1 |
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8 |
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5 |
5 |
1 |
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1 |
8 |
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6 |
5 |
1 |
1 |
1 |
7 |
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7 |
5 |
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10 |
2. 시료를 잘 섞은 다음 1번부터 6번까지의 튜브를 37℃에서 15분간 반응시킨다. 7번 튜브는 튜브받침대에 방치한다. 튜브 안쪽 벽에 용액 방울이 흩어져 있으면 1~2초간 원심분리하여 튜브 바닥쪽으로 모아준다. 원심분리기는 실험대 위에 준비되어 있다.
3. 제공된 아가로스젤을 전기영동 젤 박스에 넣고 1×TAE 완충액을 부어 젤 표면이 3-4mm 정도 잠기도록 한다. 젤에는 시료를 로딩할 수 있는 웰(구멍)이 10개 있다.
4. 8번 튜브에는 길이를 아는 DNA 스탠다드를 6㎕ 넣는다.
5. 5× 염색약 3㎕씩을 각 튜브에 넣고 잘 섞는다.
6. 먼저 DNA 스탠다드(8번 튜브) 5㎕를 첫 번째 웰에 로딩한다. 표1에 표기된 1번~7번 튜브의 시료를 두 번째 웰부터 차례로 로딩한다.
<주의> “튜브 번호와 젤 로딩 순서가 다릅니다. 주의하세요. DNA 스탠다드를 먼저 로딩.”
마이크로피펫의 팁은 매회 새 것으로 갈아 쓴다. 전기영동 젤 박스의 뚜껑을 덮는다. 파란색 카드를 들어 조교를 부른다. 조교가 전원을 켜 줄 것이다. 100V에서 40분 간 전기영동한다.
<주의> “전기영동을 하는 동안 과제2를 하시오”
7. 전기영동이 끝나면 파란 카드를 들어 실험조교에게 알리면 전원을 꺼 줄 것이다. 장갑을 끼고 젤 받침판을 들어낸다.
8. 자신의 수험번호가 붙어있는 박스로 젤을 옮긴다. 뚜껑을 덮고 박스를 실험대 위에 둔다. 실험조교가 젤 사진을 찍어서 줄 것이다.
아가로스젤 전기영동법을 이용한 플라스미드 DNA 제한효소 절편의 분리(24점: 각 레인별로 3점씩) 담당교수가 실험 결과를 채점할 것이다.
레인별 점수: DNA 확인 불능, 점수 없음; 밴드는 보이나 레인 전체에 번져 보임, 1점 감점; 부분 절단, 1점 감점; 희미한 밴드, 1점 감점
조교가 인쇄해 준 젤 사진을 아래에 붙이시오.
과제2. 제한효소 자리 및 제한 절편의 크기 결정 (16점)
시간이 부족하여 전기영동한 각자의 젤을 직접 분석하지 못한다. 아래 그림은 같은 플라스미드를 실험에서 사용한 세 종류의 제한효소로 처리한 다음 아가로스젤 전기 영동한 결과이다. 제한효소 처리 과정 및 각각의 시료를 로딩한 순서 등은 과제1의 방법과 동일하다. 이 결과를 바탕으로 물음에 답하시오.
문제1. PstI, BamHI, HindIII는 각각 이 플라스미드 DNA를 몇 번 자르는가? (3점)
A. PstI: 1, BamHI: 0, HindIII: 2
B. PstI: 2, BamHI: 0, HindIII: 2
C. PstI: 2, BamHI: 1, HindIII: 0
D. PstI: 1, BamHI: 1, HindIII: 1
문제2. 선형 람다파지 DNA에 제한효소를 처리하여 아가로스젤 전기영동시 분자크기 스탠다드로 자주 사용한다. 다음 사진은 람다파지 DNA를 HindIII로 자른 다음 전기영동한 결과이다. 사진 오른편의 숫자는 DNA 절편의 크기(kb)를 나타낸다.
다음 보기에서 옳은 것은 모두 고른 것은? (3점)
(1) 람다파지 DNA에는 HindIII 자리가 8개 있다
(2) 람다 DNA가 HindIII로 절단되는 것으로 보아 람다 DNA 분자는 전체가 다 이중나선으로 이루어진 것이 확실하다
(3) 앞 쪽의 젤 사진은 염색약과 결합한 DNA 절편의 형광 이미지이다
A. 1
B. 1, 2, 3
C. 2, 3
D. 3
문제3~5. 젤 사진에서 1번 레인의 DNA 길이 스탠다드는 모두 8개 밴드이다. 1번 레인의 DNA 절편 크기를 다음과 같다고 하자: 200, 500, 800, 1200, 2000, 3000, 4500, 7000bp. DNA 절편의 이동 거리는 절편 길이의 로그값에 반비례한다. 다음 장의 그래프 용지에 이동 거리에 대한 DNA 절편 크기의 로그값을 표기하고, 이를 바탕으로 DNA 절편의 크기를 계산하시오.
문제3. PstI 자리와 HindIII 자리 사이에 있는 절편 중 더 작은 제한효소 절편의 길이(kb)는? (3점)
A. 2.5
B. 0.8
C. 1.1
D. 0.6
문제4. HindIII와 BamHI 자리 사이에 있는 절편 중 더 작은 제한효소 절편의 길이(kb)는? (3점)
A. 0.8
B. 0.4
C. 0.5
D. 0.6
문제5. 플라스미드 DNA의 길이(kb)는? (4점)
A. 5.2
B. 6.9
C. 4.8
D. 4.3
IBO 답안지 (Practical Ⅰ)
1. D
2. D
3. B
4. B
5. D