17 th INTERNATIONAL BIOLOGY OLYMPIAD
9-16 JULY 2006
Río Cuarto República Argentina
PRACTICAL TEST(실험평가)
3
Biochemistry
(생화학)
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학생 번호: |
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17회 국제생물 올림피아드
2006. 7. 9-16
Río Cuarto República Argentina
실험평가에 관한 일반 주의사항
실험평가는 다음의 4가지 실험과제로 구성되어 있다.
No.1 식물해부(형태), 분류, 생리(평가시간: 1시간)
No.2 동물해부(형태), 분류, 생리(평가시간: 1시간)
No.3 생화학 (평가시간: 1시간 30분)
No.4 미생물학 (평가시간: 1시간 30분)
▷ 실험 과제 1과 2는 각각 1시간씩 실시한다.
▷ 실험과제 3과 4는 각각 1시간 30분씩 실시한다.
▷ 각 실험과제의 만점은 40점씩이므로 4가지 실험과제의 총점은 160점이 된다.
주의: 별도의 답안지가 없으므로 이 문제지에 답안을 작성한다.
Practical test 3 (실험평가 3) : 생화학
포도당의 효소적 정량
과제1: 여러분은 농도를 알고 있는 표준 포도당 용액을 이용해서 표준 측정곡선을 구해야 한다. 측정값을 포도당 농도 대 흡광도 그래프로 나타내시오.
중요: 스펙트로 포토미터를 사용할 준비가 되면 붉은색 카드를 들어 실험조교를 부르시오.
도입:
포도당 산화효소(GOD)는 β-D-포도당을 산화시켜 D-글루콘산과 과산화수소로 만들어준다. 이 효소는 β-D-포도당에만 특이적으로 반응하며, α-D-포도당에는 작용하지 못한다. 호스래디쉬 과산화효소(POD)는 염색약을 전자공여체로 사용하여 과산화수소를 물과 산소로 분해한다. 동시에 염색약은 산화된 형태로 바뀌게 되어 색깔을 나타낸다. 첫째 반응에서 생성된 과산화수소의 양은 반응이 얼마나 일어났는지를 나타내주기 때문에, 두 번째 반응에서 붉은 색이 나타나는 것이 전체 반응을 확인하는데 사용될 수 있다.
이것이 실제로 생체 용액에서 유리 포도당의 양을 측정하는데 이용되는 방법이다. 이것은 β-D-포도당에만 작용하지만 GOD가 포도당 총량을 측정하는데 사용될 수 있는 이유는 β-포도당이 반응에 사용되면 α-포도당이 평형을 유지하기 위해 β형으로 변환되기 때문이다.
원리
전체 반응은 다음과 같다.
GOD
Glucose+ O2 + H2O----------------> Gluconic Acid + H2O2
POD
2 H2O2 + 4-AP + 4-Hydroxybenzoate------------ > red quinoneimine
포도당 산화효소 용액: 포도당 산화효소, 과산화효소, 4-아미노페나존(4-AP), 히드록시벤조에이트를 포함한 pH 7.0의 인산버퍼용액
시약:
1. 포도당 산화효소 시약 (바로 사용가능)
2. 포도당 용액 (농도 모름)
3. 포도당 용액 5mg/ml
4. 증류수
장비:
1. 실험장갑 1쌍
2. 마커펜 1개
3. 1.5ml 튜브 18개
4. 피펫 2개
5. 배양기 (37℃)
6. 스펙트로포토미터(사용할 때는 실험 조교와 함께 사용한다.)
7. 스펙트로포토미터 큐벳 8개
8. 종이타월 3장
9. 1000ml 팁 30개
10. 200ml 팁 30개
기구:
조절방법:
용량조절을 위해서는 조절 휠을 위쪽으로 잡아당긴 후 돌려야 한다. 원하는 볼륨을 맞춘 후 조절 휠을 아래쪽으로 누르시오. P100의 최소 부피와 최대 부피는 10㎕와 100㎕임을 명심하시오. P1000의 최소 부피는 100㎕이며 최대 부피는 1000㎕이다.
사용방법:
팁을 고정시킨 후 누름 버튼을 조심스럽게 첫 번째 멈출 때까지 밀어 넣어 고정시킨 후 수직으로 용액에 팁을 담근다. 팁이 2~4mm 정도 잠기게 한 후 누름버튼을 천천히 놓아서 원래 위치로 돌아가게 만든다. 피펫을 용액에서 들어낸 다음 피펫의 팁을 용액을 담을 용기로 이동시킨다. 팁을 용기의 안쪽 벽에 가깝게 한 다음, 누름 버튼을 첫 번째 멈춤 이후까지 밀어 넣어 용액이 팁에서 완전히 방출되게 한다. 그 다음 피펫을 들고 버튼을 놓은 다음, 사용한 팁을 팁 제거 단추를 눌러 쓰레기통에 넣는다.
실험과정
1) 1.5㎖ 튜브 다섯 개에 1/2에서 1/32까지 아래 표와 같이 표지한다. 포도당 표준용액(5mg/ml)을 증류수로 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32로 연속적으로 희석하여 각각 최종 100㎖씩 만든다.
2) 잘 섞은 후, 아래 표와 같이 용액들을 다섯 개의 새로운 1.5㎖튜브에 넣어 포도당의 효소적 정량을 시작하라.
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1/2 |
1/4 |
1/8 |
1/16 |
1/32 |
대조군 |
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시료의 부피 |
10㎕ |
10㎕ |
10㎕ |
10㎕ |
10㎕ |
0 |
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물의 부피 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
10㎕ |
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포도당산화효소 용액의 부피 |
1ml |
1ml |
1ml |
1ml |
1ml |
1ml |
3) 잘 섞은 후 37℃에서 5분간 반응시킨다.
4) 각 튜브의 내용물을 스펙트로 포토미터 큐벳에 넣는다.
5) 스펙트로 포토미터로 505nm에서 흡광도를 기록한다. 대조군 시료를 스펙트로 포토미터를 영점 조절하는데 이용하시오.(스펙트로 포토미터를 사용할 준비가 되면 실험조교를 부르시오)
6) 아래의 표에 반응 용액 안의 포도당 양을 ㎍으로 적고 이 때 505nm에서의 흡광도를 적은 다음 아래의 그래프용지에 포도당 양과 흡광도 관계를 나타내시오.
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희석액 |
||||
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1/2 |
1/4 |
1/8 |
1/16 |
1/32 |
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포도당 (반응용액안의 양 ㎍) |
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505nm에서의 흡광도 |
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과제2: 앞에서 얻은 표준 곡선을 이용하여 시료의 포도당 농도를 측정하기 (10점)
1) 다음과 같이 농도를 모르는 포도당 시료를 가지고 포도당 산화효소반응을 수행하라.
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시료 |
대조군 |
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시료 부피 |
10㎕ |
0 |
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물 부피 |
0 |
10㎕ |
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포도당 산화효소 시약 부피 |
1㎖ |
1㎖ |
2) 잘 섞은 후 37℃에서 5분 동안 반응시킨다.
3) 반응물을 각각 스펙트로 포토미터 큐벳에 담는다.
4) 505nm에서 흡광도를 측정한다.(스펙트로 포토미터를 사용할 준비가 되면 조교를 부르시오.)
5) 앞에서 얻은 표준 곡선을 이용해서 시료의 포도당 농도를 mg/ml로 구하여 아래의 빈 칸에 써 넣으시오.
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시료의 흡광도 |
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시료의 농도(mg/ml) |
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질문 1. 삭제됨
질문 2. 포도당 산화효소 용액은 카탈라아제를 가지고 있을 수 있다. 이 경우 실험 결과는 다음과 같을 것이다. (3점)
A) 분석 결과 포도당의 양이 실제보다 낮게 측정될 것이다.
B) 포도당의 양이 실제보다 높게 측정될 것이다.
C) 분석에는 영향이 없을 것이다.
맞는 답 항의 기호를 아래에 쓰시오.
질문 3. 가장 적절한 pH값, 즉 효소가 가장 활성을 잘 나타내는 pH를 적정 pH라 한다. pH가 너무 높거나 낮으면 대개의 경우 효소의 활성이 완전히 없어지는데, 이것은 다음과 같은 이유 때문이다. (1점)
A) 단백질의 이차구조가 깨지기 때문이다.
B) 단백질의 삼차구조가 깨지기 때문이다.
C) 단백질의 일차구조가 깨지기 때문이다.
맞는 답을 하나만 골라 아래의 상자에 X로 표시하시오.
□A □B □C □A, B
□A, C □B, C □A, B, C
질문 4. 누룩곰팡이의 포도당 산화효소를 효모에서 과다 발현시켰다. 이 포도당 산화효소를 정제한 다음, 당화 패턴을 엔도글리코시드 가수분해효소 H와 알파만노시다아제를 처리하여 분석하였다. 효소 처리 후, 일부를 SDS-폴리아크릴아마이도 젤 전기영동 하였으며, 나머지 포도당 산화효소는 포도당을 기질로 사용하며 Km(미카엘리스-멘텐 상수)를 결정하는데 사용하였다. Km은 효소 반응이 최대 반응 속도의 ½될 때의 기질의 농도(mole/l)이다.
각각의 당화된 형태 효소의 Km 값은 그림1의 아래쪽에 나타내었다.
그림 1. 포도당 산화효소의 당화제거를 DTT가 있는 조건에서 SDS-PAGE 젤(7.5%) 전기영동으로 분석하였다. 0 레인은 분자량 크기를 보여주는 표준 시료이다. 레인 1은 처리하지 않은 효소, 레인 2는 엔도글리코시드 가수분해효소 H를 처리한 효소, 레인 3은 알파만노시다아제를 처리한 효소, 레인 4는 엔도글리코시다아제 H와 알파만노시다아제를 처리한 효소(당이 완전히 제거된 효소)이다.
그림 1의 결과로부터 얻을 수 있는 결론은?
A) 포도당 산화효소는 분자량이 96kDa의 동성이중체이다.
B) 당이 제거된 포도당 산화효소의 분자량은 약 68kDa이다.
C) 포도당 산화효소는 엔도글리코시드 분해효소 H와 알파만노시다아제를 처리하면 분자량이 작아지므로 당화가 되어있는 것이다.
D) 포도당 산화효소의 당 부분은 N-아세틸글루코사민과 만노오스를 가지고 있다.
맞는 답/ 답들을 골라 아래의 상자에 X로 표시하시오.
□A □B □C □D
각각의 당화된 효소들의 Km을 조사한 결과로부터 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다. 다음 중 옳은 서술/서술들을 고르시오.
A) 포도당에 대한 완전히 당화된 효소의 친화도는 당이 제거된 효소보다 크다.
B) 포도당 산화효소의 활성은 당이 제거되면 완전히 없어진다.
C) 당 분자가 없어지면 관찰된 Km 값의 변화를 일으킬 수 있는 효소 활성 부위의 구조 변화를 일으킬 수 있다.
맞는 답/ 답들을 골라 아래의 상자에 X로 표시하시오.
□A □B □C
질문 5. 변성을 일으키지 않는 조건에서 포도당 산화효소를 정제한 후 DTT가 있거나 없는 조건에서 SDS-PAGE 전기영동을 하였다. 결과는 그림 2와 같다. (4점)
그림 2. 비변성 조건에서 정제한 포도당 산화효소를 DTT가 있거나 없는 조건에서 SDS-전기 영동한 결과이다.
그림 1과 그림 2의 결과를 종합해서 얻을 수 있는 재조합 포도당 산화효소의 구조는 다음과 같다.
A) 당화가 되어있지 않은 단일체(monomer)이다.
B) 당화가 되어있는 단일체이다.
C) 두 분자 모두 당화가 되어 있는 동형이중체(homodimer)이다.
D) 두 단위체 중 하나만 당화가 되어 있는 이형이중체(heterodimer)이다.
맞는 답/ 답들을 골라 아래의 상자에 X로 표시하시오.
□A □B □C □D
답안지
PRACTICAL TEST (실험평가) 3
생화학
과제 1: 총 15점
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희석액 |
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1/2 |
1/4 |
1/8 |
1/16 |
1/32 |
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포도당 (반응용액안의 양 ㎍) |
25 |
12.5 |
6.25 |
3.125 |
1.56 |
|
505nm에서의 흡광도 |
0.8 |
0.4 |
0.2 |
0.1 |
0.05 |
과제 2: 총 10점
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시료의 흡광도 |
X |
←기입한 것이 맞을 경우 5점 |
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시료의 농도(mg/ml) |
1100-1400 |
← 5점 |
질문 2. (3점): A
질문 3. (1점): A, B-1점, B-0.5점, A-0.5점
질문 4.(9.6점)
□A XB XC XD
0.9 0.9 0.9 0.9
XA □B XC
2 2 2
질문 5. (4점): C