17 th INTERNATIONAL BIOLOGY OLYMPIAD

9-16 JULY 2006

R?o Cuarto  Rep?blica Argentina

PRACTICAL TEST (실험평가)

4


Microbiology

(미생물학)


학생 번호 :

 

 

 

 


17회 국제생물 올림피아드

2006. 7. 9-16

R?o Cuarto  Rep?blica Argentina



실험평가에 관한 일반 주의사항


참가자들에게


실험평가는 다음의 4가지 실험과제로 구성되어 있다.


1. 식물해부(형태), 분류, 생리(평가시간 : 1시간)


2. 동물해부(형태), 분류, 생태(평가시간 : 1시간)


3. 생화학(평가시간 : 1시간 30분)


4. 미생물학(평가시간 : 1시간 30분)



▶ 실험과제 1과 2는 각각 1시간씩 실시한다.


▶ 실험과제 3과 4는 각각 1시간 30분씩 실시한다.


▶ 각 실험과제의 만점은 40점씩이므로 4가지 실험과제의 총점은 160점이 된다.



주의 : 별도의 답안지가 없으므로 이 문제지에 답안을 작성한다.

Practical test 4 (실험평가 4) : 미생물학


  미생물을 분류하는 방법에는 여러 가지가 있지만, 가장 흔하게 사용되는 Bergey의 미생물 결정 방법이 있다.


  생화학적인 관점에서 박테리아 균주를 동정하는 개략적인 방법은 다음과 같다.


1) 균주를 분리하여 순수배양한다.


2) 살아있는 균주를 현미경으로 관찰하고, 그람염색을 실시한다. 미생물의 형태와 그람염색의 종류를 통해 미생물의 계통을 결정하게 된다. 세균이 덩어리를 이루는 모양이나 포자 그리고 다른 형태적 특성들도 좋은 분류 방법이 된다.


3) 영양적인 특징을 결정한다.(일반적으로 이것을 분리와 배양 전에 사용한다.) : 광독립성영양체, 광종속영양체, 화학독립영양체, 화학종속영양체


4) 일차검사들을 행한다. 일차검사라고 불리는 아래와 같은 검사들을 사용하여 ‘속’단계를 결정하고 경우에 따라 이들이 속한 ‘과’단계를 결정한다. 일차 검사에는 그람염색과 형태 관찰 외에 카탈라제, 옥시다제, 포도당발효, 운동성 등의 결정 등이 있다.



시약과 기구


1. 젠티안 바이올렛 용액이 들어있는 점적병


2. 루골(요오드)가 들어있는 점적병


3. 그람 탈색용 점적병


4. 사프라닌 염색액이 들어있는 점적병


5. 증류수가 들어있는 점적병


6. 튜브꽂이


7. 루리아-버타니 배지에 배양된 미생물 A와 미생물 B가 있는 2개의 칸 튜브


8. 2개의 실험용 장갑


9. 마스크


10. 실험실용 마커펜


11. 냅킨 종이


12. 분젠 버너


13. 현미경


14. 미생물 접종용 루프


15. 4개의 슬라이드 글라스


16. 슬라이드 보존용 트레이


17. 세척용 증류수가 든 플라스틱 병


18. 커버 글라스


19. 고배율용 이멀전 오일이 있는 점적병


20. 3%의 과산화 수소수가 들어있는 점적병


21. 미생물 A와 B가 배양된 루리아-버타니 아가배지가 있는 패트리 디쉬


22. 2개의 옥시다제 판이 있는 에펜도르프 튜브


23. 1개의 핀셋


24. 2개의 칸 튜브


25. 멸균증류수가 채워진 마개 있는 칸 튜브


26. 플라스틱 파스퇴르 피펫


27. 3개의 EMB아가배지가 있는 페트리 디쉬 : 1개는 미생물 A가 접종되어 있으며 1개는 미생물 B가, 나머지는 미생물을 접종하지 않은 배지


28. 3개의 페닐아라닌이 포함된 배지가 있는 튜브 : 1개는 미생물 A가 접종되어 있으며 1개는 미생물 B가, 나머지는 미생물을 접종하지 않은 튜브


29. 10%의 염화철 용액이 있는 점적병


30. 3개의 SIM(수황화 인돌 운동성 검사 배양액) 배지가 있는 칸 튜브 : 1개는 미생물 A가 접종되어 있으며 1개는 미생물 B가, 나머지는 미생물을 접종하지 않은 배지


31. 인돌 시약이 들어있는 점적병에서 한 방울 떨어뜨림.


32. 3개의 우레아 배양액이 있는 칸 튜브(1개는 미생물 A가 접종되어 있으며 1개는 미생물 B가, 나머지는 미생물을 접종하지 않은 배지)


33. 3개의 MIO(운동성 인돌 오미틴) 배지가 있는 칸 튜브(1개는 미생물 A가 접종되어 있으며 1개는 미생물 B가, 나머지는 미생물을 접종하지 않은 배지)


34. 3개의 시몬스시트르산을 가진 칸 튜브(SC-A와 SC-B로 표시되어 있는 것은 각각 A와 B 박테리아가 들어있고 SC로 표시된 것은 접종된 균이 없음)


35. 시계는 실험실 안에서 모든 학생들이 볼 수 있는 곳에 위치해야 한다.


주의 :

  모든 배지와 시약들은 단 한 번만 실험이 가능한 만큼의 분량만 제공되므로 취급에 주의해야 한다.

  조심하지 않고 실험하거나 갑작스런 움직임 혹은 버너로부터 멀리서 작업하면 배양액이 오염되거나 좋은 결과를 얻을 수 없다.

  여러분은 그 기초와 해석이 상세히 설명된 생화학적 검사를 수행할 것이다. 배양액, 시약 그리고 미생물에 대한 정보가 그림과 표 등의 형태로 주어질 것이다.


주의 : 사용한 A 균주와 B 균주를 버리지 마시오. 두 번째 과제(Task 2)에서 사용됩니다.



과제 1 : A와 B 균주에 대해 그람염색을 실시하라.


실험절차


서론 


  그람염색은 박테리아 세포벽의 2가지 종류를 구별하는데 이용된다. 어떤 미생물 종류에서는 그 세포벽의 화학적 특성 때문에 크리스탈 바올렛 염색액이 유기탈염색액(아세톤 알콜 혼합액)을 처리해도 제거되지 않는 특성이 있다.


그람염색법


1. 조사하고자 하는 미생물배양액을 유리슬라이드에 얇게 칠하고 공기에 말린다.


2. 분젠버너불꽃 사이로 3~4번 통과시켜 염색실험 과정 중 씻어내는 과정에 의해 염색하는 미생물이 씻겨나가지 않게 미생물을 유리슬라이드에 붙게 고정한다.


3. 도포된 슬라이드를 염색걸기(staining rack)에 놓고 젠티만 비올렛 용액으로 슬라이드 표면 위를 바른다.


4. 젠티안 비올렛 용액에 30초 반응하게 하고 흐르는 물에 완전하게 씻어낸다.


5. 다음 30초간 그람요오드용액(루갈용액)으로 도포 위를 덮어 첨가한다.


6. 도포슬라이드를 집게손가락과 엄지손가락 사이에 잡고 모든 비올렛 색깔이 다 없어지지 않을만큼 탈염색액(아세톤 알코올 혼합액)을 여러 방울 떨어뜨려 표면에 넘치게 한다. 이것은 보통 10초 이내가 소요된다.


7. 도포된 슬라이드를 흐르는 물에 씻고 염색걸이에 이것을 둔다. 사프라닌 주변 염색액을 20초간 표면에 처리한다. 흐르는 물에 씻는다.


8. 도포된 슬라이드를 염색걸이에 수직으로 세워놓고 과도한 수분이 흘러나가고 마르게 한다.


9. 염색된 도포슬라이드를 대물렌즈 100×배율 현미경으로 검사한다.(임머젼 오일 사용)


10. 현미경의 초점이 맞추어졌을 때 조교를 부른다.



실험결과


다음 표의 해당란에 결과를 박스에 ×로 표시하시오.


미생물

그람염색

조교의 확인

A

□ 양성

□ 음성

 

B

□ 양성

□ 음성

 


과제 2 : 미생물A와 미생물 B의 생화학적 특성


  이 부분의 실험측정에서는 이미 제공되거나, 과제 1에서 수행한 대사적 검사를 이용하여 미생물 A와 미생물 B의 과와 속을 결정하게 될 것이다.


카탈라아제 반응


  어떤 미생물들은 산소를 환원시키는 플라보 단백질을 가지고 있어서 결과적으로는 과산화수소와 슈퍼옥사이드 등이 생성되는데 이들은 짧은 시간 내에 세포내 구성성분을 파괴시킬 수 있는 강력한 산화제로서 극도로  독성이 강하다. 많은 박테리아들은 이런 독성화합물로부터 자신을 보호할 수 있는 효소를 가지고 있다.


기술


  슬라이드에 놓여있는 미생물 A와 미생물 B에 2 방울씩 과산화수소 용액을 첨가하여 카탈라아제를 가지고 있는지 검사한다.(LB-A와 LB-B로 표지된 것은 액체배양된 미생물들이다.)


주의 : 생화학 검사표에 활성이 있으면 +로, 반응이 없으면 -로 표시하여 결과를 나타내어라.


질문


  카탈라아제 효소에 의해 수행된 반응을 나타낸 것은?


1) H2O2 + NADH + H+ →  2 H2O + NAD+

2) H2O2 + H2O2 → 2H2O + O2

3) O2- + O2- + 2H+ → H2O2 + O2

4) 4 O2- + 4H+ → 2H2O + 3 O2


아래에 있는 선 위에 옳은 답의 번호를 적어라.


답 :                           


산화효소 반응


  각각 다른 속인 슈도모나스속, 니세리아속, 모락셀라속, 비브리오속, 에로모나스속에 존재하는 시토크롬-c-산화효소를 검출하는데 이용되는 방법.

  옥시다제 판들은 시토크롬-c-산화효소의 기질인 디메틸파라페닐렌디아민을 함유하고 있다.

  이 효소를 가진 미생물들은 대기산소와 옥시다제디스크에 기질이 포함된 경우 붉은 자홍색을 나타낸다.


기술

 

  다음 지시에 따라서 미생물A와 미생물B의 옥시다제 검사를 수행하라.


  옥시다제 검사는 시험관을 이용해서 수행한다. 배양한 세포를 다음과 같이 0.2㎖의 증류수에 혼탁액을 만들고 1개의 옥시다제디스크를 넣는다.


  주의 : 평판 배지에서 키운 각각의 미생물로부터 3콜로니씩을 떼어 내어 세균현탁액을 준비하고 LB-A와 LB-B로 표지한다.


결과


  일반적으로 실온에서는 1분 이내에 양성 결과들이 검출된다. 2분이 경과한 후에 결과가 나오면 음성 결과라고 간주한다.


양성 : 자혹색을 띤 디스크

음성 : 디스크의 색깔에 변화가 없음.


  주의 : +와 -를 사용하여 얻어진 생화학적 검사의 결과를 작성해 보라.



에오신 메틸렌 블루 한천배지


  이 배양액은 영양요구가 낮으며 빨리 자라는 그람음성 세균의 분리에 사용된다.


  이 배지는 장내 세균과의 속하는 모든 미생물의 성장을 가능하게 한다.


목적

  이 배양액은 장내세균과 그람음성 세균들을 선택적으로 분리하기 위한 개선방법으로 홀트-해리스 제조법과 루이스의 방법을 합한 것이다. 지표제인 에오신과 메틸렌블루의 존재하에서는 젖당고 설탕의 발효가 불가능한 미생물과 발효가 가능한 미생물을 분별할 수 있다. 또한 이 지표제들은 여러 그람양성 박테리아의 성장을 억제한다.

  이 배지에서는 많은 종류의 대장균과 스트로박터가 녹색금속 광택을 띠게 된다.

  젖당과 설탕발효 미생물의 콜로니는 녹색과 핑크색으로 둘러싸여 중심이 어두운 색의 콜로니를 나타내는 반면 젖당과 설탕을 발효시키지 못하는 미생물은 색깔이 있는 콜로니를 나타낸다.

  이 배지는 장내세균의 성장을 가능하게 하면서도 다른 미생물의 성장도 가능하게 하는데 이들은 콜로니의 모양에 따라 일반적으로 구분이 가능하다.

지시사항


  제공된 EMB배지(미생물A는 EMB-A로, 미생물B는 EMB-B로 표지된)를 이용하여 미생물A와 B의 젖당과 설탕의 이용성을 결정하라.


  주의 :  생화학적 실험결과표를 +(양성반응)와 -(음성반응)로 작성하라.



질문 


발효는 


A) 설탕의 분해로부터 기체와 산이 생성된다.


B) 혐기상태에서 성장이 느린 티오글리콜산(환원제) 배지에서 조건성 혐기성 미생물의 성장과 연관되어 왔다.


C) 미생물의 카탈라제 양성반응과 일반적으로 연관되어 있다.


아래의 선에 옳은 답에 해당하는 기호(들)를 쓰시오.


답 :                           



페닐알라닌 한천배지(시험관에 Ph로 표시함)


  페닐아라닌 한천배지는 탈아미노반응에 의해 페닐알라닌으로부터 피루브산을 생산하는 것을 검출하는데 이용된다. 이 반응의 양성반응은 10%염화철용액을 첨가하면 녹색을 나타낸다.


지시사항들


  4~5방울의 염화철 용액을 Ph-A와 Ph-B로 표시된 미생물A와 B가 배양된 경사한천 배지 튜브에 첨가하라. 시약을 첨가하면서 튜브를 회전시킨다. 페닐피루브산이 존재하면 10분 이내에 진한 녹색이 나타난다.


주의 : 생화학적 실험결과를 +(양성)와 -(음성) 표시를 이용하여 표에 적어넣어라.



황화수소 인돌 운동성배지(SIM) (시험관에는 SIM-A와 SIM-B로 표시됨)


  이 배지는 같은 시험관에서 황화수소, 인동생산, 운동성을 검사하는데 이용된다. 배지에서 황화수소의 생산은 시스틴 탈황화효소가 아닌 티오황화 혹은 황산염환원제의 작용에 의해서 유래된다. 접종한 선을 따라 검은색을 나타내면 황화수소 양성반응으로 간주한다. 이것은 보통 접종 후 18~24시간 후에 나타난다. SIM배지에서 운동성 배양은 접종선을 따라 성장이 확산되는 것으로 나타난다. 이것은 리스트리아의 특징인 “우산과 같은”은동을 검출하기에 적당한 배지이다. 인돌 생산을 검출하는데는 이 배지에 트립테인의 함량이 높아지는 현상이 이용된다.


지시사항들


  제공된  SIM튜브를 이용하여(미생물 A와 B는 각각 SIM-A와 SIM-B로 표시함), A와 B 미생물의 운동성, 인돌 생산, 황화수소 생산을 각각 결정하라.

  SIM튜브에서 강하게 자란 미생물 배양액에 인돌이라고 표시된 시약을 5방울 첨가하라. 핑크 색깔이 나타나는 것이 인돌이 존재하는 것을 나타낸다.


주의 : 얻은 생화학적 실험결과를 표에 +(양성), 혹은 -(음성)으로 나타내어라.


질문


운동성에 음성을 띠는 결과란


A) 배지에 접종한 선을 따라 성장이 일어나는 것을 나타낸다.


B) 새로 배양한 같은 미생물에서 수분이 많은 콜로니가 생성되는 것으로 확인된다.


C) 배지의 표면을 넘어서 생장하는 것이 보이기도 한다.


D) 절대 호기성, 운동성 미생물에서도 나타날 수 있다.


아래의 선 위에 해당되는 정답(들)의 기호를 써라.


답 :                           




요소 배양액


이 배양액은 유레아제 생성균주의 차별화 규명에 적합하다.


지시사항들


제공된 요소배양튜브(미생물 A와 B는 각각 UREA-A와 UREA-B로 표시됨)들을 이용하여 미생물 A와 B의 유레아제 생성여부를 결정하라.


주의 : 생화학적 실험결과표를 +(양성) 혹은 -(음성)으로 작성하라.


시몬스 시트르산 한천배지


이것은 시트르산 페이아제를 가진 미생물과 그렇지 않은 미생물을 구분할 수 있는 배양액이다.


지시사항들 


제공된 시몬스 시트릭산 튜브(미생물 A와 B는 SC-A와 SC-B로 표시하였음)를 이용하여 미생물 A와 B의 생장 유무를 결정하라.


주의 : 생화학적 실험결과표를 +(양성) 혹은 -(음성)으로 작성하라.



운동성 인돌 오르니틴(MIO) 배지


이 배지에서 관찰되는 반응들은 아래와 같다.


        ? 오르니틴 탈탄소 반응(ODC); 배지에서 아래로 3/4지역(혐기성 지역)에 pH지시약에 의한 색깔변화를 관찰하라. 정확한 결과 분석을 위해 배지에서 아래로 3/4지역까지 미생물 성장이 있어야한다.

                ? 회색, 청색, 자색 : 오르니틴 탈탄소 양성반응

                 - 높은 염기성 생성물의 생성, 포도당의 발효에 의해 생성된 과다 중성화

                ? 노란색 : 음성반응. 포도당 발효에 의한 산의 생성에 결함이 생기는 경우 노랑색을 띤다.


지시사항들


제공된 MIO시험관들(미생물 A와 B는 각각 MIO-A와 MIO-B로 표시함)을 이용하여 미생물 A와 B의 오르니틴 탈탄산효소 생성여부를 결정하여라.


주의 : 얻은 결과를 +(양성) 혹은 -(음성)을 사영하여 표에 적어놓고 완성하여라.


결과 :


다음 표에 생화학적 결과를 완성하여라.

생물체

카탈라아제

젖산

설탕

운동성

인돌

H2S

페닐알라닌

ODC

요소

시트르산

산화효소

A

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

B

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


21페이지(실제로는 12페이지)의 <별첨 1>을 이용해 A와 B의 과명과 속명을 찾아 적으시오.(9점)

 

과(Family)

속(Genus)

미생물 A

 

 

미생물 B

 

 



문제들(Questions)


1. 아래의 표와 같은 다섯 미생물 배양액을 가지고 있다. 그런데 튜브의 표지가 떨어져나가서 튜브에 올바르게 다시 표지를 해야 한다. 먼저 아래의 여러 미생물에 대한 다양한 반응을 고려해야 한다.

그람염색

형태

카탈라아제 반응

포도당반응

젖산발효

페닐알라닌 탈아미노화 효소

시트르산 소비

바실러스

(간균)

+

막대형

+

+ 또는 -

?

?

?

스타필로

코커스

+

구형

+

+

?

?

?

엔테로박터

-

막대형

+

+

+

-

+

모가넬라

-

막대형

+

+

-

+

-

슈도모나스

-

막대형

+

-

-

-

?


a. 어떤 특정 실험결과가 바실러스와 스타필로코커스를 구분할 수 있으며, 또한 이들을 나머지 다른 속들과 구분할 수 있겠는가?


A) 포도당 발효


B) 시트르산 소비


C) 카탈라아제 반응


D) 그람 염색


옳은 답을 골라 아래의 선 위에 쓰시오.


답 :                           




다음의 희석과정을 고려하여 물음에 답하시오.


a. 원래의 호숫물 시료 100㎖의 총 콜로니형성능(CFUs)은 얼마인가?

(TNTC = 세기에는 너무 많은 수)


A) 5.8 × 107 cfu/100㎖


B) 4.25 × 108 cfu/100㎖


C) 1.2 × 109 cfu/100㎖



맞는 답을 골라 아래의 선 위에 쓰시오.


답 :                           


b. 만일 호숫물을 최초로 희석할 때 1㎖의 시료를 9㎖의 희석액과 섞었다면 답이 달라지겠는가?


A) 그렇다.


B) 그렇지 않다.


맞는 답을 골라 아래의 선 위에 써 넣으시오.


답 :                           



































<별첨 1>

그람염색(새로 배양한 것)

+

+

+

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

형태

구형

구형

구형

구형

막대

막대

막대

막대

막대

막대

막대

막대

구형

집단화

덩어리

덩어리

덩어리

네개체

 

 

 

 

 

 

 

 

호기성성장

+

+

+

+

+

-

+

+

+

+

+

+

+

혐기성성장

-

+

+

+

+

+

+

-

-

-

+

+

-

운동성

-

-

-

-

-

+or-

+or-

+or-

+or-

+or-

+or-

+

-

카탈라아제

+

+

-

-

-

-

+

+

+

+

+

+

+

산화효소

 

 

 

 

 

 

 

 

+

+

-

+

+

포도당을 산 또는 산과 가스로 분해하는 발효

-

+

+

+

+

+(or-)

+

-

-

-

+

+

-

마이크로코커스

×

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

스트렙토필로코커스

 

×

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

스트랩토코커스

 

 

×

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

락토코커스

 

 

×

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

엔테로코커스

 

 

×

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

클로스타리움

 

 

 

 

 

×

 

 

 

 

 

 

 

바실러스

 

 

 

 

 

 

×

×

 

 

 

 

 

알카리제너스

 

 

 

 

 

 

 

 

×

 

 

 

 

슈도모나스

 

 

 

 

 

 

 

 

 

×

 

 

 

엔테로박테리아

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

×

 

 

에로모나스

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

×

 

크로모박테리아

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

×

 

나이제리아

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

×








































 

산화

 

 

 

 

 

 

 

 

Enterobacteriaceae

 

카탈라아제

젖산

설탕

운동성

인돌

SH2

페닐알라닌

ODC

요소

시트르산

산화효소

Escherichia

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

-

Shigella

+

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

Salmonella

+

-

-

+

-

+

-

+

-

-

-

Citrobacter

+

+/-

-

+

+

+

-

+

-

+

-

Proteus

+

-

+

+

+/-

+

+

+

+

+/-

-

Morganella

+

-

-

+

+

-

+

+

+

-

-

Enterobacter

+

+

+/-

+

-

-

-

+

+/-

+

-

Serratia

+

+/-

+/-

+

-

-

-

+/-

+

+

-

Klebsiella

+

+

+

-

-

-

-

-

+

+/-

-

Pseudomonaceae

Pseudomonas

+

?

-

+

-

-

+/-

+/-

+/-

+/-

+


답안지


PRACTICAL TEST (실험평가) 4


미생물학


과제 1 : A와 B 균주에 대해 그람염색을 실시하라.


미생물

그람염색

조교의 확인

A

□ 양성

×□ 음성

 

B

□ 양성

×□ 음성

 

10점 (5점은 A 생물, 5점은 B 생물)


질문


과제 2 : 미생물A와 미생물 B의 생화학적 특성


질문(1.6점)


카탈라아제 효소에 의해 수행된 반응을 나타낸 것은?


답 :              2             


질문 


발효는(1.6점) 


답 :        A, B               


질문


운동성에 음성을 띠는 결과란(1.6점)


답 :       A, B, C, D       




결과 :


다음 표에 생화학적 결과를 완성하여라.(11점)

생물체

카탈라아제

젖산

설탕

운동성

인돌

H2S

페닐알라닌

ODC

요소

시트르산

산화효소

A

+

(0.5점)

+

(0.5점)

+

(0.5점)

+

(0.5점)

+

(0.5점)

-

(0.5점)

-

(0.5점)

-

(0.5점)

-

(0.5점)

-

(0.5점)

-

(0.5점)

B

+

(0.5점)

-

(0.5점)

-

(0.5점)

+

(0.5점)

+

(0.5점)

-

(0.5점)

-/+

(0.5점)

+/-

(0.5점)

-

(0.5점)

+

(0.5점)

+

(0.5점)


21페이지의 <별첨 1>을 이용해 A와 B의 과명과 속명을 찾아 적으시오.(9점)

 

과(Family)

속(Genus)

미생물 A

Escherichiae(2.25점)

Escherichia(2.25점)

미생물 B

Pseudomonaceae(2.25점)

Pseudomonas(2.25점)



질문


1. (1.6점)


답 :              D              


2.  a. (1.6점)


답 :              A              


b. (2점)


답 :              B